Сроки постановки серологической реакции

Серологические реакции при сифилисе

Диагностика сифилиса основывается на клинических и лабораторных данных. Среди последних чрезвычайно ценны серологические исследования, которые проводят не только для подтверждения диагноза сифилиса, но и для наблюдения за его динамикой под влиянием проводимой терапии.

Серология сифилиса сегодня представляет собой отдельную область знаний. Созданы различные реакции, получившие в разных странах государственное признание. Важно, чтобы полученные результаты были правильно истолкованы, чего можно достигнуть лишь при знании основ серологии.

В нашей стране для серологической диагностики сифилиса в соответствии с методическими рекомендациями Министерства здравоохранения применяют:

— микрореакцию преципитации (МР) с кардиолипиновым антигеном — отборочный тест при обследовании населения на сифилис;

— реагиновый плазменный тест (RPR) также, будучи не трепонемным, используется в качестве скринингового теста;

— комплекс серологических реакций (КСР), в который входят реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами и МР;

— реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса;

— реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (в модификациях:РИФ-абс, РИФ-ц и РИФ с капиллярной кровью из пальца); в качестве антигена в РИФ используется патогенная бледная трепонема штамма Никольса;

— реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) с антигеном из культуральных или патогенных бледных трепонем;

— иммуноферментный анализ (ИФА) с антигеном из культуральных или патогенных бледных трепонем.

Все указанные реакции имеют разную чувствительность и специфичность и рекомендованы к применению в зависимости от поставленной задачи.

При массовых профилактических обследованиях населения на сифилис применяют МР с плазмой крови или инактивированной сывороткой крови обследуемых. Результаты реакции оценивают-

ся качественно как 4+, 3+, 2+ и отрицательные. Преимущество экспресс-метода заключается в быстроте получения ответа (через 30-40 мин), небольшом объеме необходимой для анализа крови (2-3 капли), которую можно брать у пациентов из пальца.

С помощью этого экспресс-метода обследуют лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на венерические болезни, больных соматических стационаров, лиц, помещенных в спецприемники. Если экспресс-метод применяется изолированно, то является лишь отборочным тестом. На основании его положительного результата диагноз сифилиса не ставят, а обследуемых направляют к дерматовенерологу для дальнейшего клинического обследования и исследования их крови с помощью любого из других диагностических тестов (КСР, РИБТ, РПГА, ИФА или РИФ). Экспресс-метод не применяют у беременных, доноров в связи с тем, что он часто дает ложноположительные результаты. Средние медицинские работники, прошедшие специальную подготовку, производят взятие крови из пальца и постановку МР. Учитывать ее результаты обязаны врачи-лаборанты.

РСК с трепонемным и кардиолипиновым антигенами применяются для подтверждения диагноза сифилиса при наличии активных проявлений болезни, для обследования лиц, бывших в половом контакте с больным сифилисом, выявления латентного (скрытого) сифилиса, эффективности проводимой терапии, при обследовании больных психиатрических и неврологических стационаров, доноров и беременных, включая лиц, направляемых на искусственное прерывание беременности.

Кровь для исследования берут в количестве 5-7 мл из локтевой вены стерильной иглой при соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь можно получить из височной вены или из надрезов на пятке. Кровь берут строго натощак (спустя 5-6 ч после приема пищи) и оставляют ее в чистых сухих пробирках на 2-3 ч при комнатной температуре для свертывания. Постановку КСР и специфических реакций производят в серологических лабораториях кожно-венерологических учреждений, а в сельской местности — в лабораториях сельских районных больниц.

Для пересылки крови для исследования в отдаленные лаборатории очень удобен метод сухой капли. Для этого на следующий день после забора крови сыворотку отделяют от сгустка. Градуированной пипеткой набирают 1 мл сыворотки и выливают ее в виде двух отдельных кружков на полоску плотной бумаги (вощаной или целлофана) размером приблизительно 6×8 см. На свободном крае бумаги надписывают фамилию, имя и отчество больного, дату забора крови и порядковый номер. Сыворотку на бумаге, защищенную от прямых лучей солнца и пыли, оставляют

на 24 ч при комнатной температуре для засыхания. После этого полоски бумаги с высушенной сывороткой свертывают и отсылают в лабораторию.

РСК в КСР с кардиолипиновым антигеном не очень чувствительна и становится положительной через 2-4 нед после возникновения твердого шанкра, причем титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимума (1:160-1:320 и выше) при вторичном свежем сифилисе. Затем титр реагинов постепенно падает и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:20. У больных с третичным сифилисом указанные реакции дают положительный результат только в 70% случаев.

Следует подчеркнуть, что КСР не является строго специфичным для сифилиса и в ряде случаев может давать ложноположительные (неспецифические) результаты. Такие ложноположительные реакции наблюдаются у больных лепрой, малярией, иногда с аутоиммунным заболеванием, новообразованиями, пневмонией, туберкулезом, заболеваниями печени, при приеме лекарственных препаратов (сульфаниламиды, глюкозиды, валериана и др.), а также во время беременности, при менструациях и т.д. При взятии крови для исследования на КСР необходимо предупреждать обследуемого, чтобы он за 2-3 дня до этого не употреблял алкоголь, жирную пищу, не принимал лекарственные препараты. Не рекомендуется исследовать кровь в течение 1-й недели после вакцинации, травм, хирургических вмешательств, при лихорадочных состояниях, в течение первых 2 нед после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни, поскольку физико-химические изменения в сыворотке крови при этих состояниях могут быть сходны с теми, которые наблюдаются у больных сифилисом.

Ложноположительные результаты могут получаться также в связи с техническими ошибками (неполный гемолиз, нестерильное взятие крови, недостаточная квалификация лаборантов).

Для отдифференцирования ложноположительных результатов КСР от истинных, для диагностики скрытых и поздних форм сифилиса, при подозрении на сифилитическую инфекцию, для установления ретроспективного диагноза заболевания рекомендуется применять специфические серологические реакции (РИБТ, РПГА, ИФА или РИФ)

Для проведения специфических серологических реакций кровь в количестве 5-10 мл берут также из локтевой вены натощак. Кровь вливают в сухую пробирку для исследования на РИФ и в стерильную пробирку для исследования на РИБТ. Постановка специфических серологических реакций на сифилис производится в специализированных лабораториях кожно-венерологических учреждений.

РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном в этой реакции служит взвесь убитых культуральных бледных трепонем, фиксированная к предметным стеклам, на которые наносят исследуемую и антивидовую флюоресцирующую сыворотки. Результаты РИФ определяют под люминесцентным микроскопом путем оценки свечения трепонем в препарате. При положительном результате трепонемы имеют желтовато-зеленое свечение, степень которого обозначают плюсами от 1 до 4; при отрицательных результатах трепонемы не светятся.

Другая специфическая реакция на сифилис — РИБТ — основана на феномене обездвиживания бледных трепонем антигенами сыворотки крови больного в присутствии комплемента. В качестве антигена для РИБТ используют взвесь живых бледных трепонем, полученных от зараженных сифилисом кроликов. Подсчет утративших подвижность (иммобилизированных) трепонем ведут под микроскопом. Результаты реакции оценивают в процентах: от 0 до 20% — отрицательная, от 21 до 30% — сомнительная, от 31 до 50% — слабоположительная, от 51 до 100% — положительная. РИБТ становится положительной в конце первичного периода сифилиса и остается таковой в течение всех периодов этого заболевания, а иногда и после полноценного противосифилитического лечения. При третичном сифилисе, специфических поражениях внутренних органов, нервной системы, при врожденном сифилисе, когда КСР часто отрицателен, РИБТ дает положительные результаты в 98-100% случаев. Диагноз скрытого сифилиса обязательно следует подтвердить положительной РИБТ.

РИБТ также может давать ложноположительные результаты, если в исследуемой сыворотке содержатся трепонемоцидные вещества (антибиотики — пенициллин, тетрациклин), вызывающие неспецифическую (токсическую) иммобилизацию бледных трепонем. Поэтому нельзя исследовать кровь на эту реакцию раньше, чем через 2 нед после окончания приема антибиотиков.

Серологические исследования можно использовать и для определения поражения сифилисом нервной системы, исследуя цереброспинальную (спинно-мозговую) жидкость больного. Ее исследуют также на наличие белка, ферментных элементов, которые свидетельствуют о патологии и помогают диагностировать ту или иную форму нейросифилиса. Цереброспинальную жидкость получают при люмбальной пункции. Проведенная асептически, она не представляет никакой опасности и может быть осуществлена врачом даже в амбулаторных условиях. Серологические исследования цереброспинальной жидкости показаны во всех случаях сифилиса

ЦНС.

Лабораторные методы диагностики сифилиса

Анализ на сифилис является одним из самых распространенных среди лабораторных исследований. Широко используются анализы на сифилис при проведении профилактических обследований. При помощи микроскопии выявляется возбудитель сифилиса — бледная трепонема. При помощи серологических реакций подтверждается диагноз сифилиса, устанавливается диагноз скрытого сифилиса, проводится контроль эффективности лечения, определяется излеченность больных.

Диагноз сифилиса устанавливается на основании клинических данных, обнаружении возбудителей сифилиса в образцах материала и подтверждении диагноза серологическими методами исследования. Проявления сифилиса многочисленны и многообразны, ввиду чего болезнь выявляется врачами разных специальностей. Дифференциальная диагностика первичного сифилиса проводится с целым рядом заболеваний.

Рис. 1. На фото первичное проявление сифилиса — твердый шанкр.

Антитела к бледной трепонеме и серологическая диагностика

При заражении сифилисом в организме больного образуются антитела. Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.

Антитела к бледной трепонеме IgM

Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения. На 6 — 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода. Антитела IgM исчезают через 1 — 2 мес. после лечения раннего сифилиса, через 3 — 6 мес. — после лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит признаком рецидива сифилиса или говорит о повторном заражении. Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.

Антитела к бледной трепонеме IgG

Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.

Неспецифические антитела

Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем. В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела — агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др. Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).

Ложноположительные анализы на сифилис

Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций. Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя. Отмечено, что с возрастом количество ложноположительных реакций возрастает.

Рис. 2. На фото первичный сифилис у женщин.

Лабораторная диагностика сифилиса с применением серологических реакций

Серологические тесты на сифилис подразделяются на трепонемные и нетрепонемные.

1. Нетрепонемные тесты

В качестве антигена в этой группе тестов используется кардиолипиновый антиген. Липидные антигены возбудителей сифилиса самые многочисленные. Они составляют 1/3 сухой массы клетки. С помощью нетрепонемных тестов выявляются антитела-реагины, которые вырабатываются против кардиолипинового антигена. В эту группу входит реакция связывания комплемента (РСКкард), реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрого определения реагинов плазмы (RPR) и др. С помощью нетрепонемных тестов проводится первичный скрининг на сифилис (обследование групп населения), а возможность получения результатов в количественном варианте позволяет использовать эти тесты с целью контроля эффективности лечения. Положительные результаты нетрепонемных тестов должны подтверждаться трепонемными тестами. Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций.

2. Трепонемные тесты

В трепонемных тестах используются антигены трепонемного происхождения, выделенные из культуры бледных трепонем. С их помощью подтверждаются положительные результаты нетрепонемных тестов. В группу входят: РСКтреп — реакция связывания комплемента, РИФ — реакция иммунофлюоресценции и ее модификации, РИТ, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ИФА — иммуноферментный анализ.

3. Тесты на сифилис с использованием рекомбинантных антигенов

Антигены для данной группы тестов получают генно-инженерным путем и используют в реакциях — РПГА и ИФА, в анализах иммуноблоттинга (ИБ) и иммунохроматографическом анализе.

Рис. 3. Для диагностики сифилиса используется комплекс серологических тестов.

Диагностика сифилиса с применением нетрепонемных тестов

Для выявления сифилиса используются нетрепонемные тесты или комплекс серологических реакций (КСР). Серологическая диагностика применятся с 5-й недели от момента заражения или с 2-3 недели после появления твердого шанкра. Антитела выявляются практически у всех больных со свежим первичным, вторичным и рецидивным сифилисом. Серологические реакции положительные у 70 — 80% больных с третичным активным сифилисом, в 50 — 60% случаев у больных третичным скрытым сифилисом.

Серологические реакции с применением нетрепонемных тестов могут давать ложноположительные результаты.

Рис. 4. Забор крови для проведения анализа на сифилис.

Реакция связывания комплемента (РСК кард, КСК с КА, реакция Вассермана)

Реакция Вассермана (RW, РВ), изобретенная А. Вассерманом более 100 лет назад, сегодня претерпела множество изменений, однако, как дань традиции, сохранила свое название по настоящее время. Реакция связывания комплемента с применением кардиолипинового антигена предназначена не только для выявления антител, но и выполняется в количественном варианте — с разными разведениями сыворотки, что позволяет использовать ее для контроля эффективности лечения. Низкая чувствительность и специфичность, получение ложноположительных результатов — отрицательные стороны данного вида исследования.

Суть реакции Вассермана заключается в следующем: антигены, которые применяются при постановке реакции Вассермана, в случае наличия антител к возбудителям сифилиса в крови человека посредством комплимента связываются с ними и выпадают в осадок. Интенсивность реакции обозначают знаком (+). Реакция может быть отрицательной (-) — отсутствие осадка, сомнительной (небольшой осадок или +), слабоположительной (++), положительной (+++) и резко положительной (++++).

Более чувствительной является видоизмененная реакция Вассермана — реакция Колмера. С ее помощью выявляются антитела в сыворотках, где реакция Вассермана дала отрицательный результат.

При резко положительных реакциях проводится количественное определение реагинов, для чего используется сыворотка в разведениях от 1:10 до 1: 320, что позволяет использовать данный вид исследования для контроля эффективности лечения. Например, снижение титра антител и последующая их серонегативация (получение отрицательных результатов), говорит об успешном излечении заболевания.

Рис. 5. Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана.

Микрореакция преципитации (МРП)

Микрореакция преципитации применяется для массовых обследований отдельных групп населения, диагностики сифилиса и контроля над эффективностью лечения. Для проведения данного вида исследования необходимо небольшого количества исследуемого материала. В основе микрореакции преципитации лежит иммунологическая реакция антиген-антитело. В случае наличия антител в сыворотке крови обследуемого комплекс антиген-антитело выпадает в осадок с образованием хлопьев. Реакция проводится в лунках специальной стеклянной пластины. Оценивается по интенсивности выпавшего осадка и величине хлопьев в (+) как реакция Вассермана. При обследовании беременных, доноров и для контроля эффективности лечения не применяется. VDRL и RPR являются разновидностями микрореакций.

Рис. 6. Вид реакции преципитации в капле на стекле.

Рис. 7. Анализ крови на сифилис — реакция микропреципитации.

Рис. 8. Набор для проведения реакции быстрого определения реагинов плазмы (Тест на сифилис RPR).

Все положительные тесты, полученные при проведении неспецифических серологических реакций, требуют подтверждения специфическими реакциями — трепонемными тестами.

Диагностика сифилиса с применением трепонемных тестов

При проведении трепонемных тестов используются антигены трепонемного происхождения. Их отрицательной стороной является невозможность использования для контроля эффективности проводимого лечения, получение положительных результатов при спирохетозах и невенерических трепонематозах и получение ложноположительных результатов при онкологических заболеваниях, лепре, некоторой эндокринной патологии. Такие тесты, как РПГА, ИФА и РИФ остаются положительными многие годы после излечения сифилиса, а в некоторых случаях и пожизненно.

РИБТ и РИФ являются более специфическими из всех серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса. Они позволяют различать ложноположительные реакции, выявлять поздние формы сифилиса, протекающие с отрицательными реакциями. При помощи РИБТ распознаются ложноположительные реакции у беременных, когда необходимо решить вопрос об инфицированности ребенка.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ, РИТ)

Суть реакции заключается в том, что антитела, находящиеся в сыворотке крови больного, обездвиживают бледные трепонемы. Отрицательной считается реакция при иммобилизации до 20% возбудителей, слабоположительная — 21 — 50%, положительная — 50 — 100%. РИБТ иногда дает ложноположительные результаты. Тест сложный и трудоемкий, однако, является незаменимым при проведении дифференциальной диагностики скрытых форм заболевания и ложноположительных результатов серологических реакций, в том числе у беременных. РИБТ дает 100% положительный результат при вторичном, раннем и позднем сифилисе, в 94 — 100% случаев — при других формах сифилиса.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Суть реакции заключается в том, что бледные трепонемы (антигены), соединенные с антителами, меченными флюорохромами, издают в люминесцентном микроскопе желто-зеленое свечение. Результат оценивается знаком (+). С помощью РИФ выявляются иммуноглобулины класса А. Реакция иммунофлюоресценции становится положительной раньше, чем реакция Вассермана. Она всегда положительная при вторичном и латентном сифилисе, в 95 — 100% случаев положительная при третичном и врожденном сифилисе. Техника проведения данного вида исследования проще, чем у РИБТ, но заменить РИФ на РИБТ невозможно, так данная реакция уступает РИБТ по специфичности. РИФ-10 (модификация РИФ) более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс более специфичны.

Рис. 9. Анализ крови на сифилис — реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИПБТ)

Суть реакции заключается в том, что сенсибилизированные сывороткой больного бледные трепонемы в присутствии комплемента прилипают к поверхности эритроцитов. Полученные комплексы при цетрофугировании выпадают в осадок. Чувствительность данного теста и специфичность близки к РИФ и РИБТ.

Иммуноферментный анализ на сифилис (ИФА)

С помощью ИФА определяются иммуноглобулины класса М и G. Методика IgM – ИФА может быть использована в качестве скринингового и подтверждающего теста. Чувствительность ИФА и его специфичность аналогичны РИФ. При сифилисе ИФА дает положительные результаты с третьего месяца инфицирования и довольно долго (иногда всю жизнь) остается положительным.

Рис. 10. Иммуноферментный анализатор.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА)

РПГА основана на способности эритроцитов, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы, в присутствии сыворотки больного склеиваться (гемагглютинация). РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса, в том числе скрытого. При применении высокого качества антигена данный вид серологической реакции превышает все остальные тесты по специфичности и чувствительности.

Рис. 11. РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса.

Рис. 12. Анализ на сифилис — реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (схема).

Рис. 13. Вид перевернутого зонтика, занимающего все дно пробирки, свидетельствует о положительной реакции. В случае, когда эритроциты оседают столбиком («пуговка») в центре дна пробирки говорят об отрицательной реакции.

Рис. 14. Тест РПГА в лабораторных условиях.

Микробиологическая диагностика

Наряду с серологической диагностикой методика обнаружения бледных трепонем (микробиологическая диагностика) играет важную роль, особенно в период серонегативного сифилиса, когда еще в крови отсутствуют антитела, но уже есть первые проявления свежего первичного сифилиса (твердый шанкр).

Биологическим материалом для исследования служит отделяемое с поверхности твердых язв (шанкров), содержимое пустулезных сифилидов, мокнущих и эрозивных папул, пунктаты инфицированных лимфатических узлов, ликвор и амниотическая жидкость, для проведения ПЦР — кровь.

Наилучшей методикой обнаружения возбудителей сифилиса является исследование биологического материала в темном поле микроскопа. Данная методика позволяет увидеть бледные трепонемы в живом состоянии изучить ее особенности строения и движения, отличить патогенные возбудители от сапрофитов.

Рис. 15. Анализ на сифилис — темнопольная микроскопия.

Рис. 16. При изучении сухих мазков используется окраска по Романовскому-Гимзе. Бледные трепонемы окрашиваются при этом в розовый цвет, все остальные виды спирохет — в фиолетовый.

Обнаружение бледных трепонем при микроскопии в темном поле — абсолютный критерий окончательной диагностики сифилиса.

Рис. 17. Для выявления бактерий применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — трепонемный тест. Специфический комплекс антиген- антитело при соединении со специфической сывороткой, меченной флюорохромом, в свете люминесцентного микроскопа дает свечение бактерий зеленоватым цветом.

Рис. 18. Возбудители сифилиса хорошо просматриваются в мазках, приготовленных по методике Левадити (импрегнация серебром). Бледные трепонемы темного цвета на фоне желтой окраски клеток инфицированных тканей.

Рис. 19. Возбудитель сифилиса при многократном увеличении.

Рис. 20. На фото колонии бледных трепонем. Получить культуру бактерий тяжело. Они практически не растут на искусственных питательных средах. На средах, содержащих лошадиную и кроличью сыворотки, колонии появляются на 3 — 9 сутки.

ПЦР на сифилис

Эффективным и перспективным сегодня является методика проведения полимеразной цепной реакции. ПЦР на сифилис позволяет получить результат в течение нескольких часов, а в собранном для диагностики материале может присутствовать хотя бы несколько возбудителей заболевания.

Рис. 21. ПЦР на сифилис позволяет обнаружить ДНК или ее фрагменты бледных трепонем.

Чувствительность данного метода исследования зависит от наличия в биологическом материале бледных трепонем и достигает 98,6%. Специфичность данного теста во многом зависит от правильного выбора мишени для амплификации при проведении диагностики и достигает 100%.

Вместе с тем, в связи с недостаточно изученной сравнительной характеристики чувствительности и специфичности прямых методов диагностики сифилиса и ПЦР, данный метод обследования в РФ для диагностики заболевания пока не разрешен.

ПЦР на сифилис разрешено проводить лишь в некоторых случаях, как дополнительный метод диагностики врожденного сифилиса, нейросифилиса, при затруднениях проведения диагностики сифилиса с использованием серологических методов исследования у ВИЧ-больных.

Рис. 22. Выявление ДНК бледной трепонемы с применением ПЦР говорит либо о наличии жизнеспособных бактерий, либо об остатках погибших, но содержащих способных к образованию дополнительных копий отдельных участков хромосомной ДНК.

ССЫЛКИ ПО ТЕМЕ

• Что такое сапрофиты
• Что такое бруцеллез
• Что такое лепра
• Что такое сифилис

Самое популярное Предыдущая статья: Вопросы диагностики, лечения и профилактики рожистого воспаления Следующая статья: Как лечить сифилис

ПОСТАНОВКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Для диагностики инфекционных болезнейнаиболее часто пользуются реакцией агглютинации, или иначе серологическая реакция сущность которой состоит в склеивании бактерий между собой под влиянием специфических антител — агглютининов, вырабатывающихся в процессе болезни в организме больного.
Серологическая реакция агглютинации может быть поставлена в пробирке и на стекле. Реакция в пробирке ставится следующим образом: 0,1 мл сыворотки крови больного разводят физиологическим раствором в 100, 200, 400, 800 и более раз. Затем в каждую пробирку добавляют по одной капле диагностикума (убитой культуры того или иного возбудителя) и все пробирки ставят в термостат при температуре 37° на 12—24 часа.
В тех пробирках, где произошло склеивание бактерий (агглютинация) и оседание их на дно пробирки, реакция считается положительной. Сыворотку можно одновременно использовать для постановки реакции агглютинации с различными диагностикумами: убитыми брюшнотифозными палочками (реакция Видаля), риккетсиями Провачека, бруцеллами (реакция Райта), протеем OXi9 (реакция Вейля—Феликса) и многими другими возбудителями инфекционных болезней.
Для постановки серологической реакции агглютинации обычно достаточно 0,2—0,3 мл сыворотки. Для получения такого количества сыворотки у больного необходимо взять 1—2 мл крови из мякоти пальца или из вены. Перед взятием крови из пальца на серологическую реакцию необходимо его тщательно обмыть, место укола протереть спиртом, а затем подсушить на воздухе или протереть эфиром.
Место прокола и инструменты должны быть сухими. Прокол кожи производят на глубину 2—3 мм либо иглой Франка, либо обычной инъекционной иглой. Укол должен быть настолько глубоким, чтобы кровь самопроизвольно выступала на поверхность кожи. Палец больного фиксируют первым и вторым пальцем левой руки, захватывая его с боков ногтевой фаланги. Первую выступившую каплю крови стирают сухой стерильной ватой. Последующие капли выдавливают в пробирку, для чего палец массируют по направлению к периферии. Руку при этом лучше держать несколько опущенной. Кровь на реакцию агглютинации можно брать в нестерильную пробирку.
Из вены кровь на серологические реакции берут обычным путем. При этом во избежание гемолиза нельзя пользоваться шприцем для насасывания крови из вены; кровь должна свободно вытекать в пробирку через иглу.
Реже в диагностических целях пользуются реакцией преципитации (осаждения) и лизиса (растворения).
Наиболее специфичными и высокочувствительными реакциями, но в то же время и наиболее сложными являются серологическая реакция связывания комплемента и реакция гемапунотинации. Кровь для этих исследований берут аналогичным образом, но в несколько большем объеме (3—5 мл).
Серологические реакции становятся положительными у больных оконце 1—2-й недели болезни; в дальнейшем титр их нарастает, что является в диагностическом отношении очень важным симптомом. Поэтому серологические реакции рекомендуется брать в динамике, т. е. повторять с интервалом в 5—10 дней.
Серологические исследования крови при вирусных болезнях обязательно производят дважды. Первую пробу берут на 1—7-й день болезни, вторую —после 15-го дня. Реакции ставятся одновременно с обеими сыворотками. Положительной серологическая реакция считается только в том случае, если титр её, со второй пробой крови превышает титр с первой пробой более чем в 2 раза.

Исследуемый материал: В первую очередь для проведения серологического анализа используют биологический материал, собранный от пациента: сыворотка крови слюна фекальные массы В некоторых случаях исследуется материал, выделенный из определённых объектов окружающей среды: вода почва

Методика проведения анализа или забора крови: Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Особенности транспортировки крови и хранения сыворотки: Сразу же после забора крови её транспортируют в специальную лабораторию, где в тот же день производится подготовка сыворотки. Хранение сыворотки допускается не более 4 – 6 дней в холодильной камере при температуре 2 – 4 градусов. При необходимости более длительного хранения, сыворотка замораживается. Во избежание нарушения качества сыворотки допускается однократное её замораживание и, соответственно, размораживание. При длительном хранении антитела теряют свои свойства и становятся частично неактивными, наиболее чувствительными к замораживанию являются иммуноглобулины класса М. После размораживания сыворотки необходимо тщательное перемешивание её до однородной массы, что способствует восстановлению концентрации антител, содержащихся в данной сыворотке.

Дата добавления: 2015-08-02; просмотров: 1025 | Нарушение авторских прав

mybiblioteka.su — 2015-2018 год. (0.098 сек.)

Виды серологических реакций

Реакции между антигенами и антителами in vitro или серологические реакции применяют для определения антигенов или антител по одному известному реагенту. В серологических реакциях можно установить титр антител в сыворотке крови при помощи известного антигена и на основании полученных данных судить об имевшем место контакте между инфекционным агентом и макроорганизмом. С помощью известных антитея, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе микроорганизмы — возбудители заболеваний людей и животных, и определен их серовариант (серовар). Серологические реакции дают возможность судить о динамике накопления антител в процессе заболевания, напряженностл иммунитета, возникающего после предохранительных прививок. Таким образом, серологические реакции в диагностических целях применяются в двух направлениях:

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для определения неизвестных антител с помощью известного антигена, и

2) для определения вида антигена (микроба) или его серовара с помощью известных диагностических антисывороток.

Серологические реакции характеризуются двумя показателями — специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигена реагировать только с гомологичными антителами. Чувствительность — это возможность определения минимальных количеств антигена или антител Внешнее проявление реакции зависит от физического состояния антигена и условий ее постановки. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые антигены — преципитацию. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinatio — склеивание) проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также химических частиц с адсорбированными на нихйиггигенами под влиянием антител в среде с електролитом. Реакция протекает в две фазы В первой фазе проходит специфическая адсорбция антител (агглютининов) на поверхности клетки, несущей соответствующие антигены (агглютиногены), во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадание его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор натрия хлорида).

Реакция агглютинации достаточно специфична и чувствительна. Однако по данным признакам она уступает другим серологическим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т. д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором еще обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Для отличия положительной реакции за счет ранее перенесенной инфекции или вакцинации от протекающего заболевания определяют динамику нарастания титра антител, которая наблюдается только при текущей инфекции.

При наличии у разных бактерий групповых и тйпоспецифических антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой за счет антител к групповым антигенам, что ‘затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных гетерогенных бактерий (антигенов) адсорбировать из антисыворотки только групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител., Полученные сыворотки называются монорецепторййми, так как содержат антитела только к одному антигенному рецептору. Они применяются для детального изучения айтигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.

Реакция непрямой, или пасивной,агглютинации(РГНА).

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитело агглютинирует антиген, предварительно адсорбированный на различных субстратах. В качестве адсорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, порошок целлюлозы и бентонита. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т. е. адсорбируют не антигены, а антитела на эритроцитах иди иных частицах. РНГА нашла широкое применение в серодиагностике различных инфекций, а также для идентификации многих микроорганизмов благодаря очень высокой чувствительности и специфичности.

Реакция преципитации

Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена (преципитиногена), находящегося в дисперсном коллоидном состоянии под воздействием специфических антител (преципитинов) в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и соответствуют теории «решетки».

Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаруживать ничтожные количества антигена. Так, например, противопневмококковая сыворотка преципитирует полисахарид пневмококка при его разведении в 1 мли. раз. Такая высокая чувствительность реакции преципитации позволила использовать ее для определения антигенов по известным антисывороткам. Для этого последовательные разведения антигена наслаивают на стандартные разведения диагностической сыворотки в пробирках. Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается преципитация.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики сибирской язвы (реакция Асколи), туляремии и других заболеваний, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка, в частности белка кровяных пятен, спермы и т.д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. В биологии реакция преципитации используется для установления степени филогенетического родства различных видов животных и растений. Феномен преципитации дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белков, содержащихся в сыворотке крови и тканях животных. Реакции ставят в различных модификациях: в пробирках, в геле и т. д. При постановке реакции в геле антигены и антитела, диффундируя в агар, образуют линии преципитации.

Реакция гемолиза.

Под влиянием антител и комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — лаковую кровь вследствие выхода гемоглобина. Реакция широко применяется в лабораторной серологической практике в качестве показателя адсорбции комплемента при постановке диагностиче-ской реакции связывания комплемента (РСК). Для реакции гемолиза используют эритроциты барана (антиген), гемолитипескую сыворотку, полученную путем гипериммунизации кроликов тем же антигеном, и комплемент — сыворотку крови морской свинки.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне). Эта реакция является одним из вариантов гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах. Присутствие клеток, секретирующих гемолитические антитела — гемолизи-ны, определяют по бляшкам гемолиза, возникающим в агаровом геле, содержащем эритроциты, при добавлении к ним исследуемой лимфо-идной ткани и комплемента. Образование бляшек наблюдается только вокруг тех клеток, которые секретируют антитела к эритроцитам или к тому антигену, который был предварительно адсорбирован на них.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция разработана Ж. Борде и О.

Жангу (1901), которые установили, что при образовании комплекса антиген — антитело происходит адсорбция комплемента. Вследствие того что этот процесс не определяется визуально, для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы использовали индикаторную гемолитическую систему — эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных эритроцитов в пробирку с исследуемой сывороткой, антигеном и комплементом гемолиз произойдет только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемент адсорбировался на системе антиген — антитело, гемолиза не будет (реакция положительная).

РСК является одной из наиболее распространенных серологических реакций для определения природы и количества антител или антигенов ввиду своей высокой чувствительности и специфичности. Она применяется для серодиагностики бактериальных, риккетсиозных, вирусных и микоплазменных инфекционных заболеваний. Под названием «реакция Вассермана» РСК нашла широкое применение для серодиагностики сифилиса. Ее универсальность состоит в том, что она может быть использована для определения не только микробных айтигенов, но и других белков любого происхождения.

Реакция иммобилизации

Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях. Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция торможения гемагглютинации

Как уже отмечалось, многие вирусы (ортомиксовирусы, арбовирусы и др.) могут адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Это изменяет поверхностные структуры и приводит к агглютинации эритроцитов. Реакция гемагглютинации не является иммунологической, поскольку она протекает без участия антисыворотки.

РТГА основана на способности антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный вирус не агглютинирует эритроциты.

РТГА широко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (антигенам).

Реакция иммунофлюоресценции (Кунса).

Для выявления микробных антигенов в тканях или патологическом материале можно использовать меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (вариантам) микроорганизмов (бактериям, вирусам и др.). Метку антител производят флюорохромами (изотиоцианат флюоресцеина и др.). Меченую антисыворотку наносят на фиксированный мазок, приготовленный из исследуемого материала. После тщательного промывания мазка на нем останутся только антитела, связавшиеся с антигеном, которые дают характерное свечение при люминесцентной микроскопии (прямой метод).

В связи с трудностями, которые встречаются при приготовлении широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, более доступным является непрямой метод Кунса. Его постановка требует лишь одной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, так как большинство диагностических сывороток приготовляется путем иммунизации кроликов. При образовании комплекса антиген — антитело флюоресцирующие антиглобулиновые антитела фиксируются на нем. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики, который по своей чувствительности и специфичности не уступает другим иммунологическим реакциям.



>Серологические реакции

Основные серологические реакции

Иммунохимический метод исследования в диагностике инфекционных болезней, области применения, основные реакции, принципы проведения, регистрация результатов

Иммунохимический анализ представляет собой высоко-эффективный метод выявления различных молекул, основанный на взаимодействии антиген-антитело. Он реализован в нескольких вариантах – иммуноферментном, радиоиммунном методах, реакции иммунофлюоресценции и др.

Иммуноферментный метод (иммуноферментный анализ, ИФА) — определение Аг или Ат с помощью Ат или Аг, ковалентно соединенных с ферментом (чаще пероксидазой хрена, реже — -глюкуронидазой, щелочной и кислой фосфатаза-ми). Образующийся иммунный комплекс выявляют с помощью фотометрического измерения оптической плотности окрашен-ных продуктов, которые образуются в результате ферментативно-го расщепления субстрата ферментом. Иммуноферментные реакции применяют для диагностики инфекционных болезней (СПИДа, вирусных гепатитов, хламидиоза, токсоплазмоза и др.), определения содержания гормонов, и др. Для метода характерна высокая специфичность и чувствительность; высокий уровень автоматизации создается благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем. Различают прямой способ, когда ферментом метят специфические Ig (Ат), и непрямой, при котором иммунный комплекс выявляют мечеными антииммуноглобулинами.

В настоящее время выпускаются тест-системы для определения антител к разным микроорганизмам. Имеются иммунофер-ментные тест-системы для выявления антител разных классов, анализ наличия которых позволяет эффективно определять фазу и стадию инфекционного заболевания, а также отличать анамнести-ческое наличие антител к возбудителю инфекции и поствакци-нальные реакции от инфекционного заболевания.

Иммуноферментные тест-системы для выявления антител и антигенов могут быть как качественными, так и количественными. Тест-системы для количественного определения иммунологических маркёров инфекционного заболевания помогают осуществлять мониторинг эффективности терапии и течения заболевания. Этот аспект особенно важен при исследовании динамики хронических инфекционных процессов.

Количественное определение иммунологических маркёров инфекционного заболевания реализуется в выражении количества антигенов или антител титром или концентрацией (обычно выражается в МЕ/мл или иных условных единицах). В последнем случае необходим стандартный образец, содержащий антигены или антитела (в зависимости от специализации тест-системы) в известном количестве, и используемый для изготовления калибро-вочного графика

Серологический метод исследования в диагностике инфекционных болезней, области применения, основные реакции, принципы проведения, регистрация результатов.

Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело (см.) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью.

Учет серологических реакций осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания Аг и Ат по образованию комплекса Аг-Ат. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами — агглютина-цией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним

Основные серологические реакции

Реакция агглютинации (РА) представляет собой один из способов выявления антигена/антител по принципу нахождения известного по неизвестному. В случае нерастворимости антигена (его корпускулярности) при добавлении к нему специфичных антител происходит формирование комплекса «антиген-антитело» в виде белкового агломерата

Основные области применения РА связаны с необходимостью индентификации микробных культур, антигенов клеток крови (А,В,0), а также с определением наличия и титра антител или антигенов в сыворотке крови в практике инфекционных болезней.

Компоненты РА: 1) диагностический компонент — антиген в виде суспензии в случае поиска антител, т.е. диагностикум, или раствор антител при необходимости идентификации антигена, т.е. диагностическая сыворотка. В случае РА чаще диагностикум называют агглютиногеном, а диагностическую сыворотку — агглютинином;

2) исследуемый материал — микробная культура в виде суспензии или выросшей на скошенном агаре, клетки крови (эритроциты при определении антигенов по системе А,В,0), сыворотка крови пациента при диагностике инфекционно-го заболевания или сыворотка крови лабораторного животного при постановке биологического/иммунологического эксперимента;

3) раствор электролита в качестве среды для разведения ингредиентов реакции и в качестве среды для постановки реакции. Обычно используют 0,15 М (0,85%) раствор хлорида натрия

Регистрация результатов РА проводится по системе 4+ в процессе визуального осмотра.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА)..

9.6. Серологические реакции и их применение.

Реакция пассивной (непрямой) агглютинации проводится для регистрации взаимодействия антиген-антитело в том случае, когда антиген водорастворим и при его связывании со специфическими антителами не происходит образования крупных видимых глазом агломератов

Чаще всего для постановки РПА (РНА) применяют эритроциты барана или частицы латекса диаметром 3-5 мк

Основные области применения РПА : определение эффек-тивности поствакцинального иммунитета (определение уровня специфических антител после вакцинации), диагностика инфекционных болезней (определение титра антител или присутствия в биологических средах пациента антигенов микроорганизма, являющегося причиной заболевания), диагностика аутоиммунных заболеваний (например, определение ревматоидного фактора).

Схема постановки и учета РПА аналогичны РА.

Реакция связывания комплемента (РСК)., РСК применяется преимущественно для диагностики инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать специфические искомому антигену антитела и регистрировать их титр.

РСК относится к сложным многокомпонентным серологи-ческим реакциям. При постановке РСК in vitro создаются 2 системы: 1 — диагностическая, 2 — индикаторная.

1 — диагностическая система включает антиген (диагности-кум), исследуемую сыворотку крови пациента, содержащую искомые антитела и комплемент. Все три ингредиента смешива-ются в определенных пропорциях и инкубируются. Во время инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-комплемент в том случае, если в исследуемой сыворотке крови пациента присутствуют антитела к антигену диагностикума. При отсутствии антител комплемент остается свободным и иммунные комплексы антиген-антитело-комплемент не образуются. Внешне образование иммунных комплексов не проявляется никакими феномена вследствие особенностей взаимодействия антиген-антитело. Для индикации образования иммунных комплексов, т.е. для регистрации результатов РСК после инкубации в диагностическую систему добавляют индикационную систему.

2 — индикаторная система представляет собой суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами к ним же (гемолитическая система, приготавливаемая аналогично гемоли-тической системе для определения активности классического пути системы комплемента, см.

лабораторную работу 6). Объединение двух систем и инкубация их при определенном режиме с последу-ющим центрифугированием позволяет зарегистрировать результа-ты РСК по феномену задержки гемолиза.

Учет РСК проводится по системе ++++:

— РСК — сопровождается полным гемолизом + РСК — сомнительный результат, ++++ РСК соответствует 100%-му связыванию антигена

Для диагностики инфекционных болезнейнаиболее часто пользуются реакцией агглютинации, или иначе серологическая реакция сущность которой состоит в склеивании бактерий между собой под влиянием специфических антител — агглютининов, вырабатывающихся в процессе болезни в организме больного.
Серологическая реакция агглютинации может быть поставлена в пробирке и на стекле. Реакция в пробирке ставится следующим образом: 0,1 мл сыворотки крови больного разводят физиологическим раствором в 100, 200, 400, 800 и более раз.

Серологические реакции.

Серологические исследования —это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.

Цели исследований — распознавание инфекционных – микробных и вирусных заболеваний, а также болезней, обусловленных нарушениями защитной иммунной системы организма.

Как проводятся исследования:

Серологические исследования основаны на физиологичеком феномене – образовании в организме, в сыворотке крови антител в ответ на попадание в организм чужеродного белка (антигена) – микроба, вируса, измененных тканей организма

Серологические методы высокоинформативны для распознавания причин миокардитов, болезни легионеров, атипичных пневмоний, кишечных инфекций, вирусных гепатитов. Они используются также для диагностики так называемых аутоиммунных заболеваний, когда в организме человека некоторые ткани так изменяют свои свойства, что становятся для него как бы чужеродными. В ответ на это в организме образуются антитела против этих структур. Выявление такого рода антител в сыворотке крови позволяет диагностировать эти серьезные болезни.

Cерологические реакции: реакция агглютинации; реакция с участием комплемента (лизис); реакция нейтрализации; реакция преципитации; реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Реакции агглютинации —это простые реакции склеивания корпускулярных антигенов с помощью антител.

Различают:

— реакция торможения гемагглютинацииоснована на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать вирусы, которые в результате теряют свойство склеивать эритроциты. Используется для диагностики вирусных болезней;

— реакция коагглютинации— разновидность реакции агглютинации, в которой антигены возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой.

Если имеется стандартные образцы антигена (возбудителя какого-либо заболевания, клеток измененной ткани), а в сыворотке крови больного обнаруживаются антитела к этому антигену, можно сделать вывод, что человек болен данной болезнью. Судят о том, есть ли антитела, по тем реакциям, в которых они участвуют с данным антигеном.

Здесь приведен пример реакции агглютинации, склеивания, появления помутнения сыворотки крови. Она наливается в ряд пробирок и разводится физиологическим раствором в разных разведениях. Затем в каждую пробирку добавляется стандарный, известный антиген, микроб или вирус. Смотрят, в каком из наибольших разведений мутнеет сыворотка – это и будет титр реакции для данного больного.

Чем титр больше, тем больше вероятность заболевания. Поэтому говорят о диагностически-значимых титрах для болезни, потому что более низкие титры могут просто говорить о случайной встрече человека с данным микробом, но без болезни. Есть еще метод исследования т.н. парных сывороток, когда кровь больного исследуется в начале заболевания и через 2 – 3 недели. Вначале антител может не быть, а в более поздних стадиях титр может повышаться. Это также свидетельствует о наличии болезни.

Реакции преципитации— реакции, в которых происходит осаждение комплекса антиген-антитело. Антиген в данном случае должен быть растворимым. Осадок комплекса антиген-антитело называется преципитатом. Реакцию ставят путем наслоения раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антиген-антитело на границе этих растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Наибольшее распространение получила реакция преципитации в полужидком геле агара (двойная иммуно-иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.). Реакцию используют для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента.

Реакция нейтрализацииоснована на способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее действие микроорганизмов или их токсинов на чувствительные клетки или ткани. При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.

Реакции с участием комплементаоснованы на активации комплемента в результате присоединения его к комплексу антиген-антитело. Если комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая тем самым гемолиз (разрушение) эритроцитов (реакция радиального гемолиза). Применяется для диагностики инфекционных болезней, в частности, сифилиса.

Реакция с использованием меченых антител или антигеновоснована на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками, меченными флюорохромами, способны светиться в ультрафиолетовых лучах люминисцентного микроскопа (реакция иммунофлюоресценции).

В иммуноферментном анализе вместо флюорохромов иммунную сыворотку можно метить ферментом (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфотаза) цвет.

Радиоиммунологический метод— количественное определение антител или антигенов, меченых радионуклидами, с применением аналогичных антигенов или антител.основана на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками, меченными флюорохромами, способны светиться в ультрафиолетовых лучах люминисцентного микроскопа (реакция иммунофлюоресценции).

Методы применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов.

Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки — это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток — в геле (по Оухтерлони).

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по — разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

>Серологические реакции>1.Выполнила студентка 208 группы лечебного факультета
Кобылецкая Татьяна. 2011г

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Серологические реакции – это
реакции взаимодействия между
антигеном и соответствующим ему
специфическим антителом in vitro,
имеющие различные внешние
проявления.
Широко используются в
микробиологических и
серологических лабораториях с
целью:
серодиагностики бактериальных,
вирусных, реже других инфекционных
заболеваний,
сероидентификации выделенных
бактериальных, вирусных и других
культур различных микроорганизмов

3. Применение СР

Для серологической диагностики:
1. обнаружение неизвестных антител с
помощью известного антигена –
диагностикума
2. обнаружение неизвестных антигенов с
помощью известных антител.
Для серологической идентификации
возбудителя – определение серогруппы,
серовара возбудителя с помощью
специфической иммунной диагностической
сыворотки

4. Фазы СР

Специфическая (невидимая,
быстрая, обратимая) –
результат взаимодействия
антигена и антитела за счет
водородных, кулоновских и
вандерваальсовых сил.
Неспецифическая (видимая,
медленная, необратимая) –
появление видимых
изменений: агглютинации,
гемолиза и т.д.

5. Параметры СР

Чувствительность реакции
указывает на концентрацию
антител или антигенов,
которая определяется с
помощью данной реакции.
Специфичность — способность
антигенов или антител
реагировать только с
гомологичными антителами,
содержащимися в сыворотке
крови, либо с гомологичными
антигенами соответственно.

6. Классификация серологических реакций

Серологические
реакции
Двухкомпонентные
Многокомпонентные
Сложные
Простые
РНА
РА
РКоА
Латексагглютинация
РТГА
РП
Сложные
РН
РНГА
РОНГА
РИФ
прямая
РИФ
непрямая
РИА
ИФА
РЭМА
РСК

7. Реакции агглютинации и преципитации

Наиболее полно механизм соединения антигена и
антитела объяснен гипотезой Маррека (теория
«решетки») и Полинга (теория «фермы») .
Маррек рассматривает соединение антигена и антител
в виде решетки, в которой антиген чередуется с
антителом, образуя решетчатые конгломераты.
Согласно гипотизе Полинга антитела имеют две
валентности (две специфические детерминанты), а
антиген несколько валентностей — он поливалентен.
При соединении антигена и антител образуются
агломераты, напоминающие «фермы» построек.

8. Реакции агглютинации и преципитации

При оптимальном соотношении
антигена и антител образуются
большие прочные комплексы,
видимые простым глазом.
При избытке антигена каждый
активный центр антител заполнен
молекулой антигена, не хватает
антител для соединения с другими
молекулами антигена и образуются
мелкие, невидимые глазом
комплексы.
При избытке антител, для
образования решетки не хватает
антигена, детерминанты антител
отсутствуют и видимого
проявления реакции нет.

9. Реакция агглютинации

Метод обнаружения корпускулярных антигенов
(бактерий, эритроцитов) путем их склеивания
антителами с образованием аггломератов –
хлопьев, в присутствии электролита NaCl.
РА используют для:
Серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя
Экспресс-обнаружения возбудителя
обнаружения антител в сыворотке крови больного животного

10. Реакция агглютинации (РА)

Компоненты реакции:
Антиген – крупный, корпускулярный, целая клетка (бактерия или
эритроцит)
Антитело – IgM (валентность 5)
Физраствор
1.
2.
3.
Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые
нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде
мелкозернистой агглютинации.
Агглютинация с Н — диагностикумом (бактерии, убитые
формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Способы постановки: РА на стекле; развернутая
РА

11. РА на стекле

— используется в основном для серотипирования выделенной чистой
культуры возбудителя, реже для ускоренного обнаружения антител
Постановка реакции:
На предметное стекло помещают каплю сыворотки (Опыт) и
каплю физраствора (Контроль)
В каждой капле распределяют взвесь бактерий
Появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации –
положительный результат
Равномерное помутнение – отрицательный результат
Опыт «+»
Контроль «-«

12. Развернутая РА

— используется в основном для обнаружения антител в сыворотке
больного
Постановка реакции:
Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин.
При этом готовят десятикратные разведения исследуемой
сыворотки и вносят одинаковые количества антигена.
При положительном результате на дне пробирки образуется
рыхлый осадок и сам раствор становится прозрачным,
отрицательный результат- помутнение раствора сохраняется
«+»
«-«

13.

Реакция агглютинации
Реакция преципитации
Механизм
Теория решетки Марека-Полинга
Антиген
Крупный,
корпускулярный, целая
клетка
Мелкодисперсный,
растворимый
Антитела
IgM
IgG

14. Реакции непрямой агглютинации

— Метод обнаружения антигенов и
антител, который основан на
способности корпускулярных
носителей( эритроцитов, шариков
латекса, клеток стафилококков)
адсорбировать на своей поверхности
растворимые антигены.
— В зависимости от типа
корпускулярного носителя различают:
РНГА
Латекс-агглютинация
РКоА

15. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Компоненты реакции:
1. Эритроцитарный диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на
них антигенами)
2. Исследуемая сыворотка
3. Физраствор
РНГА ставят в пластиковых планшетках с разведениями сыворотки крови
больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.
Титр сыворотки= 1:160 (максимальное
разведение исследуемого материала,
при котором реакция положительна)

16. Реакция обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА)

Компоненты реакции:
1. Эритроцитарный антительный
диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на
них антителами
2. Исследуемый материал
3. Физраствор
Постановка РОНГА не отличается
от РНГА
Применение: обнаружение аг
(например, бактериального
экзотоксина)

17. Латекс-агглютинация

Вариант РНА, в которой частицы латекса с
адсорбированными на них молекулами антигенов или
антител агглютинируются соответствующими
антигенами или антителами. Применяют качественный и
количественный методы. Ставят по типу агглютинации
на стекле.
антитело
Латексные
частицы,
покрытые
антигенами

18. Реакция коагглютинации

Реакцию коагглютинации применяют для
определения антигенов с помощью антител,
адсорбированных на белке А клеток стафилококка
(антительный диагностикум).
Антительный диагностикум
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту
иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии,
обработанные иммунной диагностической
сывороткой неспецифически адсорбируют антитела
сыворотки, которые затем взаимодействуют
активными центрами с соответствующими
микробами, выделенными от больных. В результате
коагглютинации образуются хлопья, состоящие из
стафилококков, антител диагностической сыворотки
и определяемого микроба.
Реакция коагглютинации

19. Реакция преципитации

— РП (от лат praecipilo осаждать) — это
формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного
антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Компоненты реакции:
1. Антиген – мелкодисперсный, растворимый
2. Антитело – IgG (валентность 2)
3. Физраствор
Преципитат образуется при смешивании антигенов и антител в
эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень
образования иммунного комплекса.
Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция
кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
Широкое распространение получили разновидности реакции
преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная
иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия,
иммуноэпектрофорез и др.

20. Реакция кольцепреципитации

Реакцию проводят в узких
преципитационных пробирках: на иммунную
сыворотку наслаивают растворимый
антиген.
При оптимальном соотношении антигена и
антител на границе этих двух растворов
образуется непрозрачное кольцо
преципитата.
Если в качестве антигенов в реакции
используют прокипяченные и
профильтрованные экстракты тканей, то
такая реакция называется реакциейтермопреципитации (реакция, при которой
выявляют сибиреязвенный гаптен).
Опыт
Контроль

22. Двойная диффузия в геле по Оухтерлони

Для постановки реакции растопленный
агаровый гель тонким слоем выливают
на стеклянную пластинку и после
затвердевания в нем вырезают лунки.
В лунки геля раздельно помещают
антигены и иммунные сыворотки,
которые диффундируют навстречу
друг другу.
В месте встречи в эквивалентных
соотношениях они образуют
преципитат в виде белой полосы.
У многокомпонентных систем
между лунками с антигенами
и антителами появляется
несколько линий
преципитата; у идентичных
АГ линии преципитата
сливаются; у неидентичных
АГ — пересекаются.
Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее
применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная
жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении
антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации.

23. Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Иммунную сыворотку с расплавленным
агаровым гелем равномерно наливают на
стекло.
После застывания в геле делают лунки, в
которые помещают антиген в различных
разведениях.
Антиген, диффундируя в гель, образует с
антителами кольцевые зоны
преципитации вокруг лунок.
Диаметр кольца преципитации
пропорционален концентрации антигена.
Реакцию используют для определения в
сыворотке крови иммуноглобулинов
различных классов, компонентов системы
комплемента и др.
Зависимость диаметра кольца
преципитации от количества аг

24. Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофоретический анализ
представляет собой сочетание
электрофореза в агаровом геле с
иммунодиффузией.
Принцип ИЭФ состоит в следующем:
Вначале проводят
электрофоретическое разделение
белков в забуференном геле агара;
после разделения в канавку, которая
идет в направлении миграции белков,
вносят преципитирующую иммунную
сыворотку.
АГ и АС диффундируют в геле
навстречу друг другу, и в месте их
взаимодействия возникают
дугообразные линии преципитации,
число, положение и форма которых
дают представление о составе
исходной смеси антигенов.

25. Реакция нейтрализации токсина

Тип иммунологической реакции, основанный на способности
специфических антител – антитоксинов подавлять биологическую
активность экзотоксинов бактерий при образовании комплекса аг-ат.
РН
In vivo
На животных
На человеке
In vitro
Реакция
флоккуляции
РН в геле по
Оухтерлони
РОНГА, РНАт

26. Реакция нейтрализации токсина in vivo

Контрольная группа
(Вводят
исслед.материал
Исслед.материал+ ат
против токсина А
Исслед.материал+ ат
против токсина В
Исслед.материал+ ат
против токсина Е

27. Реакция нейтрализации токсина in vivo

Проба Шика проводится для оценки
состояния антитоксического
иммунитета;
внутрикожно вводят минимальное
количество токсина:
• При наличии антител против
дифтерийного токсина видимых
изменений не будет
• При отсутствии антитоксического
имммунитета наблюдается
воспалительная реакция

28.

Реакция флоккуляции основана на
способности токсина или анатоксина при
смешивании в определенныхсоотношениях с
антитоксической сывороткой образовывать
помутнение- инициальную флоккуляцию
Механизм реакции флоккуляции аналогичен
таковому реакции преципитации.
Применяется для титрования антитоксических
сывороток и определения типа токсина
Специфическую активность или силу
анатоксина определяют в реакции
флоккуляции в так называемых единицах
флоккуляции— (Lf) .
Силу антитоксической сыворотки выражают в
международных антитоксических единицах –
МЕ
Одна антигенная единица анатоксина
обозначается Limes flocculationis (Lf — порог
флоккуляции), это то количество анатоксина,
которое вступает в реакцию флоккуляции с
одной единицей антитоксина.
То есть, условие инициальной флоккуляции:
nLF=n МЕ
В данном опыте помутнение –
инициальная флоккуляция –
происходит в пробирке №3
Каждая пробирка содержит
2х20=40Lf токсина
Поскольку условие инициальной
флоккуляции: nLF=n МЕ, то в
данной пробирке 40 МЕ
сыворотки
Если 0,4 мл сыворотки содержат
40МЕ, то 1мл- 100МЕ

29.

Штаммы возбудителя
дифтерии — С. diphtheriae
могут быть токсигенными
(продуцирующими экзотоксин)
и нетоксигенными.
Образование экзотоксина
зависит от наличия в бактериях
профага, несущего tox-ген,
кодирующий образование
экзотоксина.
При заболевании все изоляты
тестируются на токсигенность
— продукцию дифтерийного
экзотоксина с помощью
реакции преципитации в агаре
Главное преимущество –
отсутствие необходимости
выделения чистой культуры

30. Реакция нейтрализации токсина in vitro. РНГА

Учет.
В положительном случае эритроциты
оседают на дне лунки в виде ровного
слоя клеток со складчатым или
зазубренным краем (зонтик), в
отрицательном — оседают в виде
пуговки или колечка.
Вывод: В сыворотке больного
обнаружен ботулотоксин тип Е.
Учет результатов РНГА, поставленной с
целью обнаружения ботулотоксина.
Возбудитель ботулизма — Clostridium
botulinum вырабатывает токсины семи
сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще
других встречаются серовары А, В, Е.
Все токсины отличаются по антигенным
свойствам и могут быть дифференцированы
в реакциях типоспецифическими
сыворотками.
Для этой цели можно поставить реакцию
пассивной (непрямой) гемагглютинации с
сывороткой больного, в которой
предполагается наличие токсина, и
эритроцитами, нагруженными антителами
антитоксических противоботулинических
сывороток типов А, В, Е.
Контролем служит нормальная сыворотка.

31. Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ

РОНГА — применяют антительный
эритроцитарный диагностикум эритроциты, на которых адсорбированы
антитела. Антиген –дифтерийный токсин
«+»
«-«

32. Реакция нейтрализации токсина in vitro. РОНГА, РНАТ

РНАТ позволяет быстро выявить неизвестный антиген.
Компоненты реакции:
Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином
Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против
дифтерийного токсина)
Исследуемая сыворотка ?
Принцип метода
(
? +
)
+
Результаты:
«-«
«+»
При отсутствии антигена в исследуемой сыворотке
диагностикум взаимодействует со стандартной сывороткой и наблюдаем
гемагглютинацию
При наличии антигена в исследуемой сыворотке антитела в нашей
диагностической сыворотке будут нейтрализованы и агглютинации
эритроцитов не будет

33. Реакции с участием комплемента

Сущность этих реакций
состоит в том, что при
взаимодействии
специфических антител с
антигенами клеток
(эритроцитов, бактерий), на их
поверхности образуется
комплекс антиген-антитело,
который активирует
комплемент по классическому
пути, вследствие чего
наступает лизис этих клеток.

34. Реакция иммунного бактериолиза

Нативная сыворотка обладает
бактерицидной активностью,
В иммунной сыворотке в
присутствии специфических
антител-бактериолизинов и
комплемента лизис бактерий
идет существенно
интенсивнее
Под воздействием бактериолизинов в присутствии
комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму
(набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.
Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации
холерных вибрионов (р. иммобилизации вибрионов
холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в
сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при
лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса).

35. Реакция иммунного гемолиза

Как видно из
результатов опыта,
гемолиз происходит
только в присутствии
аг (эритроциты
барана),
соответствующих
антител и
комплемента
В отсутствии одного
из ингредиентов
гемолиза не
наблюдается

36. Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК — сложная серологическая реакция. В ней
участвуют комплемент и две системы антиген
— антитело.
Первая система – специфическая :антиген,
антитело (испытуемая сыворотка) и
комплемент (сыворотка морских свинок)
Вторая система – неспецифическая
индикаторная – гемолитическая (эритроциты
барана с гемолитической сывороткой,
лишенной собственной активности
комплемента).

37. Реакция связывания комплемента (РСК)

PCK проводят в две фазы 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я
фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической
системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.
+
—
При соответствии друг другу антигенов и
антител они образуют иммунный комплекс, к
которому через Fc-фрагмент антител
присоединяется комплемент (С), таким образом
происходит связывание комплемента
комплексом антиген — антитело, и тогда во
2-й фазе гемолиз сенсибилизированных
антителами эритроцитов не произойдет
(реакция положительная)
Если антиген и антитело не соответствуют друг
другу (в исследуемом образце нет антигена или
антитела), комплемент остается свободным и во
2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз
(реакция отрицательная).

38. РСК. Титрование комплемента

В приведенном примере титр
комплемента в разведении 1:10
равен 0,15 мл.
В опыте активность
комплемента может снизиться
за счет неспецифической
адсорбции его другими
компонентами реакции, поэтому
для опыта количество
комплемента увеличивают:
берут следующую за титром
дозу. Это — рабочая доза.
В приведенном примере она
равна 0,2 мл комплемента в
разведении 1:10.
Так как все компоненты, участвующие в РСК,
должны быть взяты в равных объемах (в нашем
примере он равен 0:5 мл), необходимо к
рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10)
добавить 0,3 мл изотонического раствора
Для приготовления гемолитической системы
смешивают равные объемы гемолитической
сыворотки и взвеси эритроцитов.

39. РСК. Основной опыт

Специфическая система:
1. Антитела (сыворотка в различных
разведениях).
2. Антиген — диагностикум
3. Комплемент по 0,5 мл
Смешивают, инкубируют 60 минут при
37°С.
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 К1
К2
К3
К4
Индикаторная система Добавляют по 2 мл
гемолитической системы (ГС)
Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С.
К1 – контроль сыворотки (сыворотка +
комплемент+ГС
К2 – контроль антигена
Учитывают результаты реакции.
(антиген+комплемент+ГС)
К3- контроль гемолитической системы (2мл
В нашем примере результат
ГС+физраствор)
положительный.
К4 – контроль комплемента (2 мл ГС+ 0,5мл
Титр сыворотки 1:80
комплемента)

40. Микрореакция связывания комплемента (МРСК)

Пример МРСК с парными
сыворотками
В сыворотке, взятой через 5
дней после первого
исследования титр выше,
что свидетельствует о
развитии иммунного ответа
на данный антиген
Микрореакция ставится
по тому же принципу, что
и РСК, но с меньшими
объемами в микроплатах

41. Реакция радиального гемолиза (РРГ)

Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в
лунках геля из агара, содержащего эритроциты
барана и комплемент.
После внесения в лунки геля гемолитической
сыворотки (антител против эритроцитов
барана) вокруг них, в результате радиальной
диффузии антител, образуется зона гемолиза.
Таким образом можно определить активность
комплемента и гемолитической сыворотки, а
также антитела в сыворотке крови у больных
гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.
Для этого на эритроцитах адсорбируют
соответствующие антигены вируса, а в лунки
геля, содержащего данные эритроциты,
добавляют сыворотку крови больного.
Противовирусные антитела взаимодействуют с
вирусными антигенами, адсорбированными на
эритроцитах, после чего к этому комплексу
присоединяются компоненты комплемента,
вызывая гемолиз

42. Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса)

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция
иммунофлюоресценции, реакция Кунса) — качественный метод
выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с
флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и
специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний
(идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также
для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров
лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных
материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи
флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое
применение в диагностической практике.
Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата
флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными
белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

43. Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса)

Различают две разновидности
метода: прямой, непрямой.
Прямой метод РИФ основан на
том, что антигены тканей или
микробы, обработанные
иммунными сыворотками с
антителами, меченными
флюорохромами, способны
светиться в УФ-лучах
люминесцентного микроскопа.
Бактерии в мазке,
обработанные такой
люминесцирующей
сывороткой, светятся по
периферии клетки в виде каймы
зеленого цвета.
АГС (антиглобулиновая
сыворотка)
Пневмококки

44. Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса)

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении
комплекса антиген — антитело с помощью
антиглобулиновой (против антитела) сыворотки,
меченной флюорохромом.
Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают
специфическими антителами антимикробной
кроличьей диагностической сыворотки.
Затем антитела, не связавшиеся антигенами
микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах
антитела выявляют, обрабатывая мазок
антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой,
меченной флюорохромами.
В результате образуется комплекс микроб +
антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи
антитела, меченные флюорохромом.
Этот комплекс наблюдают в люминесцентном
микроскопе, как и при прямом методе..
Treponema pallidum

45. Иммуноферментный анализ (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)

С помощью ИФА определяют наличие
антигенов
возбудителей
различных
инфекций, но значительно чаще метод
ИФА применяется для определения
наличия антител классов IgA, IgM, IgG к
антигенам
различных
возбудителей
болезней.
Лабораторный
иммунологический метод
качественного или
количественного
определения различных
соединений,
макромолекул, вирусов и
пр., в основе которого
лежит специфическая
реакция антигенантитело.
Метод основан на
использовании антител с
использованием
фермента в качестве
метки.

46. Иммуноферментный анализ Прямой твердофазный ИФА

Фотография микропланшета
При проведении этого варианта ИФА
высокоспецифичные поли- или
моноклональные антитела, адсорбированные
на твердой фазе, инкубируют с исследуемым
образцом.
После процедуры отмывания в лунки вносят
меченные ферментом антитела (конъюгат)
Результат ИФА.
Связанный с антителом фермент обнаруживают
Желтый цвет раствора в лунке
по изменению цвета раствора после
является положительным
добавления субстрата (перекись водорода) и
результатом.
хромогена

47. Иммуноферментный анализ Непрямой твердофазный ИФА

В зависимости от цели анализа используют
разные антиглобулиновые реагенты,
выявляющие антитела всех изотипов, либо
специфичные к отдельным классам и подклассам
иммуноглобулинов.
Основное достоинство метода состоит в
универсальности конъюгата. Один и тот же
коньюгат может служить для выявления антител
человека к самым разным антигенам в любых
образцах.
Этот вариант ИФА используют
обычно для выявления
специфических антител.
В лунках панелей адсорбируют
стандартный антиген и
инкубируют с образцами
сыворотки или другого
биологического материала,
полученного от больного
(спинномозговая жидкость,
слюна и др.).
Специфические антитела,
связавшиеся с антигеном на
твердой фазе, выявляют с
помощью антиглобулинового
конъюгата(антиглобулиновая
сыворотка с ферментной
меткой).

48. Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА

Искомый антиген(1)
и меченый ферментом антиген(2)
конкурируют друг с другом за антитела (3),
сорбированные на твердой фазе.
Этот вариант анализа основан на
конкуренции меченых (конъюгат) и
немеченых (исследуемых) антител за
связывание с антигеном, адсорбированным
на твердой фазе.
Количество фермента, присоединившегося
к твердой фазе, уменьшится
пропорционально содержанию в смеси
свободных антител.
Для определения антигена используется тот
же вариант, но в этом случае искомый
антиген конкурирует с меченым,
стандартным антигеном за связывание с
антителами, иммобилизованными на
поверхности твердой фазы
> 49. Иммуноферментный анализ Общая схемаАнализатор иммуноферментный
полуавтоматический
Иммуноферментный автоматический
анализато

50. Радиоиммунологический анализ

Рис. 8. Радиоиммунологический анализ:1 — антиген; 2 — антитело; 3 — радиоактивная метка.
2
1
Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание
антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом,
подавляется в присутствии немеченного антигена.
Методика РИАпроста и включает следующие основные этапы:
А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу
(содержащую неизвестное количество немеченного антигена).
Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы
число мест связывания было намного меньше общего числа
антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать
максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.
Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре.
Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с
антителами, при этом образуются иммунные комплексы,
содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким
образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют
меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные
меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных
комплексов обратно пропорционально количеству немеченного
антигена в пробе.
В.Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их
отделяют от свободного меченного антигена. Иммунные
комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем
свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют
радиоактивность осадка.
3
Радиоиммунологический анализ:
1 — антиген;
2 – стандартныйантиген с
радиоактивной меткой;
3 — антитело.
РИА — один из самых чувствительных
методов иммунодиагностики. Его
применяют для выявления антигена вируса
Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной
кривой.
гепатита В , у больных вирусным
гепатитом.

51. Иммуноблоттинг

Антигены возбудителя разделяют с
помощью электрофореза в
полиакриламидном геле,
затем переносят их (блоттинг — от англ,
blot, пятно) из геля на активированную
бумагу (1) или нитроцеллюлозную
мембрану
и проявляют с помощью ИФА.
Фирмы выпускают такие полоски с
«блотами» антигенов. На эти полоски
(стрипы) наносят сыворотку больного (2).
Затем, после инкубации, отмывают от
несвязавшихся антител больного и
наносят сыворотку против
иммуноглобулинов человека, меченную
ферментом (3).
Образовавшийся на полоске комплекс
выявляют
добавлением хромогенного субстрата
(4), изменяющего окраску под действием
фермента.
Пример: Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций (Токсоплазмоз, Краснуха,
Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)