Содержание
Классификация питательных сред
Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.
Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85–100°С, а при охлаждении до 45–48°С образует гель.
Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.
Простые среды.
Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.
Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясо-пептонный бульон;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).
Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (1,5–3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5–7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2–3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах.
Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5–10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности.
Сывороточный бульон или сывороточный агар получают путем добавления к простым средам 15–20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков.
Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек.
Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.
Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20–22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.
Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.
Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.
Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).
Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.
Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.
Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.
Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.
Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) – среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.
Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.
Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются, когда нет возможности быстрого посева на питательные среды.
Для бактерий наиболее употребительны консерванты:
а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого глицерина и 1,0 л физиологического раствора;
б) боратная смесь;
в) фосфатно-буферная смесь.
Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.
Специальные среды.
В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин).
Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.
Термостаты
Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.
Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.
Методика приготовления пластинчатого агара
МПА расплавляют на водяной бане, затем остужают до 50-55°С. Горлышко флакона обжигают в пламени спиртовки, открывают чашки Петри так, чтобы вошло горлышко флаконы, не прикасаясь к краям чашки, выливают 10–15 мл МПА, закрыв крышку, покачивают чашку, чтобы среда равномерно распределилась, оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. После подсушивания чашки с пластинчатым агаром хранят на холоде.
Посев петлей
Стерильной остуженной петлей берут каплю материала, левой рукой приоткрывают один край чашки, вносят петлю внутрь и у противоположного края делают петлей несколько штрихов на одном месте, затем петлю отрывают и засевают материал параллельными штрихами от одного края чашки к другому с интервалом 5–6 мм. В начале посева, когда микробов на петле будет много, они дадут сливной рост, но с каждым штрихом микробов на петле остается все меньше, и они будут оставаться одиночными и давать изолированные колонии.
Посев по методу Дригальского
Этот метод используется при посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой (гной, испражнения, мокрота). Для посева по методу Дригальского берут шпатель и несколько чашек (3–4). Шпатель – это инструмент, изготовленный из металлической проволоки или стеклянного дрота, загнутого в виде треугольника или Г-образно. Материал петлей или пипеткой вносят в первую чашку и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды, этим же шпателем, не прожигая его, втирают материал в питательную среду во второй чашке, а затем – в третьей. При таком посеве в первой чашке будет сливной рост, а в последующих чашках вырастают изолированные колонии.
Выделение чистой культуры по Щукевичу
Для посева берут свежеприготовленную питательную среду с конденсатом. Исследуемый материал забирают петлей и вносят его осторожно, соблюдая правила асептики, не касаясь среды и стенок, в конденсационную воду. Бактерии с высокой подвижностью «выползают» на влажную поверхность скошенного агара.
В результате самостоятельной работы студент должен знать:
1. Классификацию, морфологию грибов, их методы изучения.
2. Классификацию и морфологию актиномицетов.
3. Правила противоэпидемических режимов и техники безопасности.
Уметь:
1. Дифференцировать микроорганизмы при микроскопии.
2. Микроскопировать окрашенные препараты.
3. Обеззараживать материал, обрабатывать руки дезинфирующими препаратами.
4. Приготавливать препараты из чистых культур.
Питательные среды для культивирования стафилококков
Для выделения культур стафилококков обычно используют 5%-ный кровяной агар (кровь овцы, кролика, крупного рогатого скота). При исследовании образцов, содержащих постороннюю микрофлору, целесообразно использовать селективные среды.
Таблица 9. Дифференциальные признаки стафилококков, имеющих основное медицинское значение
Признак | S. aureus | S. epidermidis | S. saprophyticus | |
Anaerobius | Aureus | |||
Наличие каротиноидного сегмента | – | ± | – | + |
Способность к росту в анаэробных условиях (тиогликолевая среда) | + | + | + | ± |
Рост на средах с 10% NaCI | + | + | ± (слабо) | + |
Рост при: | ||||
15°С | ? | + | – (слабо) | + |
45°С | – | + | + | ± |
Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях: | ||||
ксилоза | – | – | – | – |
арабиноза | – | – | – | – |
раффиноза | – | – | – | – |
сахароза | + | + | + | + |
маннит | – | + | – | ± |
манноза | – | + | ± | – |
трегалоза | – | + | – | + |
лактоза | – | + | ± | ± |
галактоза | – | + | ± | – |
фруктоза | + | + | + | + |
ксилит | – | – | – | ± |
Восстановление нитратов | – | + | + (слабо) | – |
Щелочная фосфатаза | + | + | + | – |
Гиалуронидаза | + | + | + | ? |
Уреаза | ? | ± | + | + |
Коагулаза (на сыворотке кролика) | + | + | – | – |
Фибринолизин | ? | ± | ± | ? |
Гемолитическая активность | + | + | – (слабо) | – |
ДНКаза | + | + | – (слабо) | – |
Чувствительность к новобиоцину (МИК >1,6 мкг/мл) | + | + | + | – |
С целью дифференциации патогенных стафилококков от сапрофитных, а также от микрококков, используют среды, позволяющие одновременно определить один из признаков, характеризующих патогенные стафилококки. Приводим рецепты некоторых питательных сред.
Молочно-солевой агар
В 100 мл МПБ растворяют 6,5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121°С 20 минут. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45°С, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5% хлорида натрия.
Лактозо-солевой бульон с фенолротом
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 минут. При росте коагулазоположигельных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).
Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 минут при 121°С. Перед использованием в среду добавляют 100 мл 30%-ной желточной эмульсии (на физиологическом растворе), 0,4 мл стерилизованного фильтрацией 1%-ного водного раствора полимиксина М, 10 мл стерилизованного автоклавированием (121°С 15 мин) 1%-ного водного раствора теллурита натрия.
Среда Джиолиотта и Кантони
В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115°С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 мл 1%-ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтрацией, При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.
Среда Бэрда-Паркера
К 90 мл основной среды с температурой 45°С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4°С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией; распределяют по поверхности, подсушивают. Колонии коагулазоположительных стафилококков черные, блестящие, с узкой серо-белой полосой и окружены прозрачной зоной.
Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001%-ном растворе HgCl2. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора.
Глициновый раствор. Глицин — 20 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют при 120°С 15 минут.
Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. Стерилизуют фильтрацией.
Желточно-солевой агар Чистовича
В расплавленный МПА с 10% хлорида натрия (рН 7,2), охлажденный до температуры 60°С, добавляют желточную эмульсию. После тщательного перемешивания питательную среду разливают в чашки Петри.
Среда Чаплина-Бернса
К 100 мл МПА добавляют 3,3 мл 0,1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием (110°С 30 минут). Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.
Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)
Вариант 1: пептон — 1%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, дрожжевой экстракт — 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Среду стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).
Вариант 2: пептон — 1%, дрожжевой экстракт — 0, 25%, желатин — 3%, лактоза — 0,2%, D-маннит — 1%, натрия хлорид — 7,5%, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5%, агар-агар — 1,5%. Стерилизуют 90 минут при 110°С, устанавливают рН 7,0.
Молочно-солевой агар
- •Методы общей бактериологии
- •Предисловие
- •Введение
- •Бактерии рода Bacillus
- •Bacillus anthracis
- •Распространение
- •Морфология возбудителя
- •Культуральные свойства
- •Профилактика
- •Bacillus cereus
- •Диагностика
- •Прочие виды, имеющие значение
- •Питательные среды для культивирования бактерий рода Bacillus
- •Бактерии рода Clostridium
- •Распространение
- •Морфология и культуральные свойства возбудителя
- •Морфология колоний
- •Антигенная структура
- •Метаболическая активность
- •Патогенность
- •Токсины и клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Столбнячная палочка
- •Распространение
- •Морфология возбудителя
- •Антигенная структура
- •Биохимия
- •Патогенность
- •Клинические проявления
- •Иммунитет
- •Лабораторная диагностика
- •Clostridium botulinum
- •Распространение
- •Морфология возбудителя
- •Антигенный состав
- •Биохимические свойства
- •Патогенность
- •Иммунитет
- •Лабораторная диагностика
- •Clostridium novyi
- •Морфология и культуральные свойства
- •Антигенная структура
- •Биохимические свойства
- •Патогенность
- •Лабораторная диагностика
- •Прочие возбудители анаэробной раневой инфекции
- •Clostridium histolyticum
- •Clostridium septicum (палочка Гона-Сакса)
- •Clostridium chavoei
- •Clostridium sporogenes
- •Clostridium sordellii
- •Clostridium fallax
- •Clostridium bifermentans
- •Clostridium difficile
- •Питательные среды для культивирования клостридий
- •Грамположительные, аэробные и факультативные кокки.
- •Микроорганизмы рода Staphylococcus
- •Staphylococcus aureus
- •Патогенез поражений
- •Лабораторная диагностика
- •S. Epidermidis
- •S. Saprophyticus
- •Питательные среды для культивирования стафилококков
- •Молочно-солевой агар
- •Желточно-солевой агар Чистовича
- •Среда Чаплина-Бернса
- •Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков)
- •Микроорганизмы рода Streptococcus
- •Стрептококки группы а.
- •Распространение
- •Патогенез поражений
- •Лабораторная диагностика
- •Стрептококки группы в
- •S. Pneumoniae (пневмококк)
- •Распространение
- •Морфология и культуральные свойства
- •Патогенез поражений
- •Клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Негемолитические стрептококки
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Прочие стрептококки
- •Распространение
- •Клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования стрептококков
- •Бактерии рода Listeria Общая характеристика возбудителя
- •Дифференциация листерий от микроорганизмов других родов
- •Внутривидовая дифференциация листерий.
- •Listeria monocytogenes
- •Listeria innocua
- •Listeria welshimeri
- •Listeria seeligeri
- •Listeria ivanovii
- •Listeria grayi
- •Listeria murrау
- •Лабораторная диагностика
- •Общие положения
- •Материалы для исследования
- •Рецепты и способы приготовления питательных сред для выделения листерий
- •Триптозный агар.
- •Сывороточный агар.
- •Кровяной агар.
- •Бульон Левинталя с трипафлавином и налидиксиновой кислотой
- •Среда с ацетатом таллия и налидиксовой кислотой (tn).
- •Среда с тиоцианатом и налидиксовой кислотой (ptn).
- •Агар с триптофлавином и налидиксовой кислотой.
- •Мак Брайда листериозный агар mla
- •Модифицированный листериозный агар Мак Брайда
- •Селективный агар Мак Брайда
- •Обогащенная среда для выделения листерий
- •Агаровая среда для выделения листерий
- •Среда для выделения листерий (lpm)
- •Селективная среда pal cam
- •Селективная среда для выделения листерий (pal cam)
- •Селективная среда для листерий
- •Селективная среда для листерий
- •Селективная среда cnpa
- •Селективная среда
- •Листериозная селективная среда feindt
- •Селективная среда для выделения листерий Oxford
- •Бактерии рода Erysipelothrix
- •Распространение
- •Морфология и культуральные свойства
- •Антигенная структура.
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования е. Rhusiopathiae
- •Микроорганизмы рода Actinomyces
- •Распространение
- •Морфология и культуральные свойства возбудителя
- •Патогенез поражений
- •Клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •A. Bovis
- •A. Viscosus
- •A. Hordeovutaeris
- •A. Pyogenes
- •A. Suis
- •A. Humiferis
- •Питательные среды для культивирования актиномицетов
- •Микроорганизмы рода Pseudomonas
- •Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)
- •Распространение
- •Морфология и тинкториальные свойства возбудителя
- •Культуральные свойства
- •Биохимические свойства
- •Пигментообразование
- •Патогенез
- •Антигенная структура
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Pseudomonas (Burkholderia) cepacia
- •Pseudomonas (Burkholderia) mallei
- •Распространение
- •Морфология и тинкториальные свойства
- •Культуральные свойства
- •Биохимия
- •Патогенез поражений
- •Клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei (палочка Уитмора)
- •Распространение
- •Морфология и тинкториальные свойства
- •Культуральные свойства
- •Биохимическая активность
- •Патогенез
- •Клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования и идентификации псевдомонад
- •Микроорганизмы рода Frаncisella
- •Распространение
- •Морфология
- •Культуральные свойства
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования франциселл
- •Микроорганизмы рода Yersinia Общая характеристика
- •Морфология
- •Антигенная структура
- •Патогенез
- •Клинические проявления у человека
- •Лабораторная диагностика
- •Общие положения.
- •Материалы для исследования
- •Порядок исследования материала
- •Оценка результатов бактериологического исследования.
- •Питательные среды для культивирования иерсиний Фосфатно-буферный раствор (фбр)
- •Буферно-казеиново-дрожжевая среда (бкд)
- •Дифференциально- диагностическая среда Серова
- •Среда с индикатором бромтимоловым синим (бтс)
- •Универсальный скошенный столбик
- •Щелочной раствор
- •Среда Кларка для аутоагглютинации
- •Микроорганизмы рода Pasteurella
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования пастерелл
- •Микроорганизмы рода Brucella
- •Распространение
- •Морфология
- •Антигенный состав
- •Биохимические характеристики
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования бруцелл
- •Микроорганизмы рода Haemophilus
- •Haemophilus influenzae (палочка Афанасьева-Пфейффера)
- •Морфология
- •Культуральные свойства
- •Антигенная структура
- •Н. Pleuropneumoniae
- •Н. Parasuis
- •H. Paracuniculis
- •H. Paragallinarum
- •H. Avium
- •H. Somnus
- •H. Agni
- •H. Equigenitalis
- •Питательные среды для культивирования гемофильных бактерий
- •Микроорганизмы рода Campylobacter
- •Группа Campylobocter jejuni (с. Jejuni, с. Coli, с. Lari) Культуральные свойства
- •Антигенная структура
- •Патогенез
- •Лабораторная диагностика
- •Распространенность
- •С. Fetus подвид fetus
- •С. Coli
- •С. Sputorum sb. Mucosalis
- •Spirillum pulli
- •Питательные среды для культивирования и идентификации кампилобактерий
- •Бактерии рода Leptospira
- •L. Interrogans
- •Морфология и культуральные свойства
- •Распространенность
- •Патогенез поражений
- •Лабораторная диагностика
- •Питательные среды для культивирования лептоспир
- •Бактерии рода Mycobacterium
- •Патогенез поражений и клинические проявления
- •Лабораторная диагностика
- •Выделение возбудителя
- •Биологическая проба
- •Серологические исследования
- •Кожные пробы с туберкулином
- •Дополнительные лабораторные методы
- •Лечение
- •Профилактика туберкулеза
- •Mycobacterium bovis
- •Мycobacterium africanum
- •Мycobacterium avium
- •Мycobacterium paratuberculosis
- •Мycobacterium intracellulare
- •Питательные среды для культивирования патогенных микобактерий
- •Микрорганизмы рода Mycoplasma
- •Морфология
- •Культуральные свойства
- •Биохимические свойства
- •Антигенная структура
- •Факторы патогенности
- •Патогенез
- •Питательные среды для культивирования микоплазм
- •Группа Rickettsiaceae
- •Морфология патогенных риккетсий (род Rickettsia)
- •Размножение
- •Культуральные свойства
- •Принципы лабораторной диагностики
- •Род Coxiella
- •Род Rochalimaea
- •Род Еhrlichia
- •Список литературы
- •
Практическая работа
1. Изучение мазков из чистой культуры стафилококка, окрашенных по Граму (зарисовать)
В препарате из чистой культуры видны грамположительные кокки, располагающиеся скоплениями в виде “виноградных гроздьев”. Могут встречаться единичные кокки или маленькие кучки.
2. Изучение мазков из гноя, окрашенных по Граму (зарисовать)
В мазке, на фоне клеточного детрита, окрашенного в розовый цвет, видны лейкоциты и грамположительные кокки, расположенные одиночно или небольшими кучками, не образующие капсул. Расположение кокков позволяет предположить длительность заболевания. Если заболевание свежее, то микробы располагаются внеклеточно, в более поздние сроки болезни можно наблюдать кокки, фагоцитированные лейкоцитами.
3. Изучение характера роста стафилококков на кровяном агаре (зарисовать)
Посев на кровяном агаре позволяет определить тип гемолизина, выделяемого стафилококками. Гемолитическая активность является одним из признаков патогенности стафилококков. Для приготовления кровяного агара, к 1,8 % МПА расплавленного и остуженного до 45–50 градусов добавляют 5% дефибринированной или свежевзятой крови животного (кролика, барана, крупного рогатого скота) или человека. После тщательного перемешивания агар разливают по чашкам. Гемолизин стафилококков вызывает растворение стромы эритроцитов, поэтому вокруг колоний стафилококков, обладающих гемолитической активностью, образуются светлые зоны гемолиза. Штаммы, образующие альфа-гемолизин, вызывают гемолиз кроличьих и бараньих эритроцитов, бета-гемолизин вызывает тепло-холодовой гемолиз только бараньих эритроцитов. Вокруг колоний стафилококков без гемолитической активности кровяной агар не изменен.
4. Изучение характера роста стафилококков на желточно-солевом агаре (ЖСА) (зарисовать)
Посев на желточно-солевом агаре проводят для определения лецитовителлазы (лецитиназы). Для приготовления ЖСА к 10% солевому агару, расплавленному и остуженному до 60 градусов, добавляют 10% желточной взвеси (1 желток асептично взбалтывают в 200 мл физиологического раствора), агар тщательно смешивают и разливают в чашки.
St.aureus образует на желточно-солевом агаре непрозрачные круглые, слегка выпуклые колонии золотистого или желтого цвета. Среда вокруг колоний мутнеет за счет расщепления липовителлина (комплекс жира и белка), содержащегося в желтке ферментом лецитиназой. В результате действия фермента от липовителлина отрываются жирные кислоты, степень дисперсности белка уменьшается, происходит преципитация его, что приводит к помутнению среды. Освобождение жирных кислот сопровождается образованием “радужного” ореола вокруг колоний (лецитиназоположительные стафилококки).
St.epidermidis на желточно-солевом агаре образует колонии белого цвета или лимонно-желтые с ровным краем, среднего размера. Среда вокруг колоний не изменена (лецитиназоотрицательные стафилококки).
5. Изучение характера роста стафилококков на молочно-солевом агаре (зарисовать)
Молочно-солевой агар используют для выделения стафилококков из материала, обильно обсемененного микробами, а также для определения пигмента образуемого стафилококками. Для приготовления молочно-солевого агара к 6,5% солевому агару, расплавленному и остуженному до 50 градусов, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока. Агар тщательно перемешивают с молоком и разливают в чашки. Для лучшего выявления пигмента посевы инкубируют 18-20 часов при 37 градусах, а затем до 2 суток при комнатной температуре в рассеянном свете.
St.aureus образует колонии золотистого цвета средних размеров, блестящие, выпуклые. St.epidermidis образует подобные колонии белого цвета. St. citreus (только как образующий пигмент) образует подобные колонии лимонно-желтого цвета.
6. Изучение лабораторной диагностики стафилококковых инфекций по схеме (зарисовать)
Основные методы микробиологического исследования:
— микроскопический
— бактериологический
Микроскопический метод. Метод основан на обнаружении стафилококков при микроскопическом исследовании мазков из материала, которые окрашивают по Граму. Под микроскопом изучают гной, отделяемое ран, слизь и налеты с миндалин и другой материал, содержащий большое количество микробов. Микроскопическое исследование крови не производят, так как кокки в мазках обнаружить не удается. Жидкий материал наносят на предметное стекло пипеткой или петлей. Густой материал растирают на стекле в капле воды, материал с тампона размазывают по стерильному предметному стеклу. В мазках обнаруживают грамположительные кокки среди лейкоцитов или внутри них. Отмечают степень обсемененности. Определить вид кокков в мазке не всегда удается, поэтому микроскопическое исследование носит ориентировочный характер. Но даже обнаружение в материале типичных по морфологии стафилококков не позволяет поставить диагноз инфекции, потому что присутствие стафилококков в исследуемом материале не всегда является доказательством его этиологической роли, по морфологии невозможно отдифференцировать патогенные стафилококки от непатогенных. Поэтому наряду с микроскопическим исследованием обязательно проводят бактериологическое исследование.
Бактериологический метод. Бактериологический диагноз основан на выделении чистой культуры стафилококка путем посева и определения его патогенных свойств. Этот метод используется также для установления источника инфекции факторов передачи инфекции, определения схемы антибактериальной терапии, ее эффективности, контроля за лечением и эпидемическим режимом в лечебных учреждениях. Важным условием бактериологической диагностики является определение качественных и количественных критериев содержания патогенного стафилококка.
Исследование гноя (слизи из носа или зева, налета)
Для посева материала выбирают необходимые питательные среды. Стафилококки к питательным средам неприхотливы и способны расти на МПА. Но для повышения высеваемости и возможности провести количественный учет и надежно отличить патогенные стафилококки от непатогенных используют элективные питательные среды. В качестве элективных сред используют молочно-солевой, желточно-солевой агар или молочно-желточно-солевой агар. Элективность этих сред обеспечивается высоким содержанием хлорида натрия (6,5–10%), добавленное молоко позволяет определить цвет образуемого пигмента, а яичный желток – выявить лецитовителлазную (лецитиназную) активность, которая является одним из факторов патогенности стафилококков.
Для посева материала используют также кровяной агар, который дает возможность определить наличие пигмента и гемолитическую активность. Однако нужно помнить, что результат исследования (наличие гемолитической активности) зависит от вида крови, ее концентрации, густоты крови, присутствия и характера сопутствующей флоры. Поэтому использование кровяного агара рекомендуется для первичного посева материала, не содержащего другой микрофлоры.
Для оценки обсемененности производят количественный посев материала, готовя из него разведения, и высевают по 0,1 мл из разведений десять во второй, десять в четвертой и десять в шестой степенях. С тампона засевают цельный материал. Посевы на ЖСА инкубируют в течение 2 суток, а на кровяном агаре – 18–20 часов.
Так как ЖСА является элективной средой, то на нем вырастают только колонии стафилококков. Обращают внимание на наличие лецитиназоположительных колоний, подсчитывают их, отбирают 2-3 колонии для дальнейшего исследования. Если на ЖСА вырастают только лецитиназоотрицательные стафилококки, то из посева тоже отбирают не менее 2 колоний. И лецитиназоположительные и лецитиназоотрицательные стафилококки отсевают на скошенный мясопептонный агар. После суточного инкубирования выделенную культуру изучают в мазках, окрашенных по Граму, определяя морфологию микробов и чистоту культуры. При наличии в мазке грамположительных кокков, расположенных характерными гроздьями, проводят исследование для идентификации стафилококков. Согласно генотипической классификации род Staphylococcus относится к семейству Staphylococcасеае, класс Bacilli, в которое входят также роды: Jeotgalicoccus, Macrococcocus, Nosocomiicoccus, Salinicoccus. Общими признаками для представителей этого семейства является то, что все они грамположительные кокки. Для установления принадлежности к роду Staphylococcus проводится первичная идентификация по наличию каталазы и способности ферментировать глюкозу в анаэробных условиях.
Стафилококки ферментируют маннит в анаэробных условиях (табл.10). Микрококки не ферментируют глюкозу в анаэробных условиях, так как они облигатные аэробы.
Таблица 10
Законодательная база Российской Федерации
действует Редакция от 07.07.2010 Подробная информация
Наименование документ | «МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВНЕДРЕНИЮ И ПРИМЕНЕНИЮ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ ПРАВИЛ И НОРМАТИВОВ САНПИН 2.1.4.1116-02 «ПИТЬЕВАЯ ВОДА. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ ВОДЫ, РАСФАСОВАННОЙ В ЕМКОСТИ. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА». МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1184-03″ (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 15.01.2003) (ред. от 07.07.2010) |
Вид документа | классификация, методика, методические указания, перечень |
Принявший орган | главный государственный санитарный врач рф, минздрав рф |
Номер документа | МУ 2.1.4.1184-03 |
Дата принятия | 01.01.1970 |
Дата редакции | 07.07.2010 |
Дата регистрации в Минюсте | 01.01.1970 |
Статус | действует |
Публикация |
|
Навигатор | Примечания |
«МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВНЕДРЕНИЮ И ПРИМЕНЕНИЮ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ ПРАВИЛ И НОРМАТИВОВ САНПИН 2.1.4.1116-02 «ПИТЬЕВАЯ ВОДА. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ ВОДЫ, РАСФАСОВАННОЙ В ЕМКОСТИ. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА». МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1184-03″ (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 15.01.2003) (ред. от 07.07.2010)
Приложение 9. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Приготовление питательных сред
Среда Бонде
Натрий лимоннокислый трехзамещенный | 28 г |
Натрий-аммоний фосфорнокислый | 15 г |
Калий фосфорнокислый однозамещенный | 10 г |
Магний сернокислый (сульфат магния) | 2 г |
Вода дистиллированная | 1000 мл |
Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют при 1 атм. 20 мин. Перед посевом добавляют 5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 100 мл среды.
Среда «Блеск»
100 мл питательного агара, стерильного, приготовленного из сухого препарата по прописи на этикетке, расплавляют на водяной бане. После охлаждения до температуры (приблизительно) 50 °C добавляют 0,3 г L-аргинина, 8 мл 10% водного раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), 10 мл стерильного обезжиренного теплого молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки нетонким слоем (не менее 25 мл).
Выполнение анализа
Исследуют пробу воды объемом 1000 мл, разделенную в две емкости по 500 мл. В каждую емкость добавляют по 50 мл среды Бонде, тщательно перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 часов.
Через 24 часа просматривают посевы. При наличии роста Pseudomonas aeruginosa происходит помутнение среды Бонде и на поверхности появляется тонкая прозрачная пленка, часто поднимающаяся по стенке емкости. В журнале отмечают помутнение среды и образование пленки.
Для подтверждения Pseudomonas aeruginosa делают посев на среду «Блеск». Емкость перед посевом не взбалтывать. Петлей забирают пленку и делают посев штрихом для получения изолированных колоний и по 3 — 4 бляшки из каждой емкости. Посев в виде бляшки: делают укол петлей до дна чашки и затем растирают небольшую площадку вокруг укола по поверхности среды. Допустимо делать посев нескольких проб на секторах одной чашки. Посевы со средой «Блеск» инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 часов.
Емкости со средой Бонде оставляют в термостате еще на 24 часа для окончательного учета.
Через 24 часа отмечают характер роста на среде «Блеск». При наличии в пробе Ps. aeruginosa на среде «Блеск» вырастают темно-красные колонии с золотистым блеском или золотистыми вкраплениями на «бляшках». Появление блеска можно наблюдать уже через 20 — 22 часа инкубации при температуре 37 °C, но максимального развития реакция достигает через 42 — 44 часа.
Если на среде «Блеск» не отмечено роста или выросли колонии темно-красные, темно-вишневые, но без характерного блеска, то из емкостей, где отмечено помутнение или помутнение с пленкой, высев следует повторить через 48 часов.
При отсутствии роста в среде Бонде через 24 часа пробу инкубируют до 48 часов и в случае помутнения и образования пленки подтверждают Ps. aeruginosa на среде «Блеск», как указано выше.
Подтвердить наличие Ps. aeruginosa также можно путем посева подозрительной изолированной колонии на косяк с питательным агаром, на котором через 24 часа инкубации при температуре 37 °C в случае положительной реакции появляется синий, сине-зеленый, зелено-желтый пигмент. Пигментация может усиливаться при последующем выдерживании косяка на свету при комнатной температуре.
Отрицательный ответ выдают:
— при отсутствии признаков роста в посевах пробы в среду Бонде;
— при отсутствии роста на среде «Блеск»;
— при росте на среде «Блеск» не характерных для Ps. aeruginosa колоний без блеска.
Результат сообщают: Ps.aeruginosa не обнаружена в 1000 мл воды.
Положительный ответ выдают:
— при росте на среде «Блеск» темно-красных колоний с золотистым блеском;
— при образовании характерного пигмента на питательном агаре.
При четкой реакции на среде Бонде (муть и пленка) и среде «Блеск» наличие пигмента определять не обязательно.
Результаты вносят в протокол анализа: Ps. aeruginosa обнаружена в 1000 мл воды.
Приложение 10
(обязательно)
Питьевая вода и водоснабжение населенных мест (стр. 6 )
При росте на фильтрах типичных колоний лактозоположительных бактерий и подтверждении их принадлежности к группе ОКБ (либо с отрицательным оксидазным тестом, либо ферментирующих глюкозу до кислоты и газа) их число суммируют, сумму делят на три и в протоколе анализа указывают: число КОЕ ОКБ/100 мл; и число КОЕ ГКБ/100 мл. В данном случае результаты по ОКБ и ГКБ — одинаковые, поскольку ОКБ ферментируют как лактозу, так и глюкозу до кислоты и газа.
При росте на фильтрах помимо типичных еще и розовых колоний оксидазоотрицательных бактерий, а также только розовых подсчитывают число колоний, ферментирующих глюкозу до кислоты и газа при температуре 37 °C, затем суммируют с числом ОКБ, делят на три. В протоколе анализа указывают результат: число КОЕ ГКБ/100 мл.
Обнаружение оксидазоположительных колоний служит показанием к проведению анализа на обнаружение Ps. aeruginosa.
Определение общих и глюкозоположительных колиформных бактерий титрационным методом
Ускорение анализа достигают использованием на первом этапе анализа в качестве среды накопления глюкозопептонной среды. Этот прием позволяет в одном посеве определять ОКБ и ГКБ, что возможно благодаря способности ОКБ ферментировать как лактозу, так и глюкозу как основной биохимический признак семейства Enterobacteriaceae. Кроме того, накопление колиформных бактерий в среде с глюкозой происходит более интенсивно за счет быстрого разложения глюкозы по сравнению с лактозой, что сокращает время анализа на сутки.
Выполнение анализа
Глюкозопептонную среду готовят так же, как лактозопептонную, заменив углеводлактозу на глюкозу МУК 4.2.1018-01.
Исследуемый объем воды 300 мл засевают в три емкости с 10 мл концентрированной глюкозопептонной среды по 100 мл в каждую емкость. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1 ) °C в течение 24 часов.
Отсутствие изменения среды позволяет дать отрицательный ответ.
Из посевов в среду накопления, где отмечено помутнение и газообразование или только помутнение, производят высев на сектора среды Эндо с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течениечасов.
При обнаружении роста на секторах, характерных для колиформных бактерий колоний, выполняют оксидазный тест одним из способов (нанесением штрихом колонии каждого типа на полоску фильтровальной бумаги, смоченной реактивом; нанесением капли реактива на часть сектора).
Отрицательный ответ дают в следующих случаях:
— в среде накопления нет признаков роста;
— на секторах среды Эндо нет роста;
— на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);
— все колонии на секторе оказались оксидазоположительные.
В протоколе анализа сообщают: отсутствие ОКБ в 300 мл и отсутствие ГКБ в 300 мл.
При обнаружении на секторах роста типичных оксидазоотрицательных колоний — темно-красных, красных, с металлическим блеском или без него — дают ответ о наличии ОКБ и ГКБ в пробе воды. В протоколе анализа сообщают: обнаружение ОКБ в 300 мл, обнаружение ГКБ в 300 мл.
Если на секторах не выявлен рост типичных колоний, а обнаружены розовые оксидазоотрицательные колонии и при этом в среде накопления установлено газообразование — дают ответ о наличии ГКБ. В протоколе анализа сообщают: обнаружение ГКБ в 300 мл.
Данный анализ является качественным. При необходимости получения количественного результата производят посев в глюкозопептонную среду трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл и устанавливают в каждой емкости наличие ОКБ и ГКБ, как указано выше.
При определении ОКБ учитывают емкости, при высеве из которых на среде Эндо обнаружены типичные колонии.
При определении ГКБ учитывают в сумме емкости, где на секторах среды Эндо обнаружены типичные колонии ОКБ, а также розовые, при газообразовании в среде накопления выдают ответ: НВЧ КОЕ ОКБ в 100 мл или НВЧ КОЕ ГКБ в 100 мл.
Результаты определяют по таблице МУК 4.2.1018-01.
Примечания. В соответствии с СанПиН единицей измерения ОКБ ГКБ и ТКБ является 100 мл, а норматив по этим показателям — отсутствие колиформных бактерий в 300 мл.
Норматив — это научно обоснованная величина, указывающая (при его соблюдении) на вероятность обеспечения эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций.
Единица измерения 100 мл условно принята для выражения количественного результата в целях сопоставления данных на международном уровне, а также при исследовании воды различных
объектов и при работе разными методами (мембранным или титрационным). При работе титрационным методом результат может быть высчитан только на 100 мл в соответствии с международными статистическими таблицами расчета НВЧ (наиболее вероятного числа) микроорганизмов.
Приложение 9
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Приготовление питательных сред
Среда Бонде
Натрий лимоннокислый трехзамещенный 28 г
Натрий-аммоний фосфорнокислый 15 г
Калий фосфорнокислый однозамещенный 10 г
Магний сернокислый (сульфат магния) 2 г
Вода дистиллированная 1000 мл
Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют при 1 атм. 20 мин. Перед посевом добавляют 5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 100 мл среды.
Среда «Блеск»
100 мл питательного агара, стерильного, приготовленного из сухого препарата по прописи на этикетке, расплавляют на водяной бане. После охлаждения до температуры (приблизительно) 50 °C добавляют 0,3 г L-аргинина, 8 мл 10% водного раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), 10 мл стерильного обезжиренного теплого молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки нетонким слоем (не менее 25 мл).
Выполнение анализа
Исследуют пробу воды объемом 1000 мл, разделенную в две емкости по 500 мл. В каждую емкость добавляют по 50 мл среды Бонде, тщательно перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течениечасов.
Через 24 часа просматривают посевы. При наличии роста Pseudomonas aeruginosa происходит помутнение среды Бонде и на поверхности появляется тонкая прозрачная пленка, часто поднимающаяся по стенке емкости. В журнале отмечают помутнение среды и образование пленки.
Для подтверждения Pseudomonas aeruginosa делают посев на среду «Блеск». Емкость перед посевом не взбалтывать. Петлей забирают пленку и делают посев штрихом для получения изолированных колоний и по 3 — 4 бляшки из каждой емкости. Посев в виде бляшки: делают укол петлей до дна чашки и затем растирают небольшую площадку вокруг укола по поверхности среды. Допустимо делать посев нескольких проб на секторах одной чашки. Посевы со средой «Блеск» инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 часов.
Емкости со средой Бонде оставляют в термостате еще на 24 часа для окончательного учета.
Через 24 часа отмечают характер роста на среде «Блеск». При наличии в пробе Ps. aeruginosa на среде «Блеск» вырастают темно-красные колонии с золотистым блеском или золотистыми вкраплениями на «бляшках». Появление блеска можно наблюдать уже черезчаса инкубации при температуре 37 °C, но максимального развития реакция достигает черезчаса.
Если на среде «Блеск» не отмечено роста или выросли колонии темно-красные, темно-вишневые, но без характерного блеска, то из емкостей, где отмечено помутнение или помутнение с пленкой, высев следует повторить через 48 часов.
При отсутствии роста в среде Бонде через 24 часа пробу инкубируют до 48 часов и в случае помутнения и образования пленки подтверждают Ps. aeruginosa на среде «Блеск», как указано выше.
Подтвердить наличие Ps. aeruginosa также можно путем посева подозрительной изолированной колонии на косяк с питательным агаром, на котором через 24 часа инкубации при температуре 37 °C в случае положительной реакции появляется синий, сине-зеленый, зелено-желтый пигмент. Пигментация может усиливаться при последующем выдерживании косяка на свету при комнатной температуре.
Отрицательный ответ выдают:
— при отсутствии признаков роста в посевах пробы в среду Бонде;
— при отсутствии роста на среде «Блеск»;
— при росте на среде «Блеск» не характерных для Ps. aeruginosa колоний без блеска.
Результат сообщают: Ps. aeruginosa не обнаружена в 1000 мл воды.
Положительный ответ выдают:
— при росте на среде «Блеск» темно-красных колоний с золотистым блеском;
— при образовании характерного пигмента на питательном агаре.
При четкой реакции на среде Бонде (муть и пленка) и среде «Блеск» наличие пигмента определять не обязательно.
Результаты вносят в протокол анализа: Ps. aeruginosa обнаружена в 1000 мл воды.
Приложение 10
(обязательно)
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ
Принцип метода определения колифагов
Метод заключается в предварительном размножении колифагов в среде обогащения в присутствии E. coli и последующем его выявлении в виде зон лизиса (просветления) на газоне E. coli на питательном агаре.
Выполнение анализа при определении колифагов
Подготовка посуды, питательных сред (питательный агар готовят по способу, указанному на этикетке), мембранных фильтров, ведение культуры E. coli, методика подтверждения фаговой природы лизиса выполняется на МУК 4.2.1018-01.
Накануне проведения анализа культуру E. coli засевают в две пробирки со скошенным агаром. Через 18 +/- 2 ч инкубации при температуре 37 +/- 1 °C производят смыв бактерий с косяков 5 мл стерильного физиологического раствора и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 109 бактериальных клеток в мл.
В исследуемую воду объемом 1000 мл вносят 100 мл 10-кратного питательного бульона и 10 мл смыва E. coli. Для контроля культуры 0,1 мл смыва E. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.
Подготовленную пробу воды и чашку Петри с контролем E. coli помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 +/- 2 ч.
После инкубации, при отсутствии колифагов на контрольной чашке, в стерильную пробирку отливают 10 мл и эту пробу освобождают от бактериальной флоры одним из двух методов.
1. В 10 мл пробы добавляют 1 мл хлороформа, пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают в течение 3 — 5 минут для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют на 15 минут при комнатной температуре для полного осаждения хлороформа. Для дальнейшего исследования отбирают 1 мл пробы, не касаясь хлороформа.
2. 10 мл пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мм, подготовленный по п. 7.1 МУК 4.2.1018-01. Фильтрат в объеме 1 — 2 мл отбирают в стерильную пробирку, помещенную в колбу Бунзена или непосредственно в стерильную колбу Бунзена. Полученный фильтрат используют для дальнейшего исследования.
В предварительно расплавленный и остуженный до 45 °C питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий E. coli из расчета 1,0 мл смыва на 100 мл агара. В стерильную чашку Петри пипеткой переносят 1 мл пробы освобожденной от сопутствующей бактериальной флоры одним их двух предложенных методов. Сверху пробу заливают подготовленным агаром. В качестве контроля E. coli дополнительно заливают одну стерильную чашку Петри. Залитые чашки осторожно покачивают для равномерного распределения агара. После застывания агара чашки переворачивают и помещают в термостат на 18 +/- 2 ч при (37 +/- 1) °C.
Если исследуется несколько проб, то целесообразно использовать одну чашку Петри, которую необходимо залить агаром с E. coli. После застывания агара разделить его поверхность на сектора (не более 6), пронумеровать их согласно количеству исследованных проб. На каждый сектор нанести каплю микропипеткой или штрихом стерильной бактериологической петлей из исследуемой пробы воды, оставив один сектор в качестве контроля.
Учет результатов
Просмотр чашек после инкубирования осуществляется в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса газона E. coli, наличии отдельных зон лизиса или единичных бляшек на чашке с исследуемой пробой воды при отсутствии зон лизиса или отдельных бляшек на контрольной чашке или контрольном секторе.
В протоколе отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 1000 мл воды.
При наличии зон лизиса в контроле результат считается недействительным. Анализ следует повторить с новой культурой E. coli.
Приложение 11
(обязательное)
КОНТРОЛЬ ЗА СОДЕРЖАНИЕМ ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ В ВОДЕ
Очищенная вода не должна содержать ооцист криптоспоридий. Исследование проводят в соответствии с МУК 4.2.964-00 (п. 2.1). Далее полученный осадок распределяют равномерно на предметных стеклах (не менее 4) и высушивают на воздухе. На тщательно высушенный мазок наносят 2 — 3 капли смеси Никифорова (смесь равных частей серного эфира и 96° этилового спирта) на минут. После чего предметные стекла ставят вертикально и тщательно высушивают.
После этого мазки быстро проводят над пламенем горелки и окрашивают карболовым фуксином (см. раздел 4.3) в течение не менее 20 минут. Мазки промывают дистиллированной водой, обесцвечивают (дифференцируют%-ной серной кислотой в течениесекунд и снова промывают. Затем дополнительно окрашивают 0,2%-ным водным раствором метиленового синего или 5% малахитовой зелени в 10% этиловом спирте в течение 3 — 5 минут. Промывают дистиллированной водой, тщательно высушивают на воздухе и исследуют с масляной иммерсионной системой микроскопа с увеличением не менее 1000 x.
Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром 5 — 6 микрон с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержимым (можно наблюдать наличие 4 веретенообразных темноокрашенных спорозоитов) на синем или зеленом основном фоне.
Приложение 12
(рекомендуемое)
СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ПРОИЗВОДСТВА РАСФАСОВАННОЙ ВОДЫ (ПРИ СОКРАЩЕННОМ АНАЛИЗЕ В КАЖДОЙ ПАРТИИ И СОКРАЩЕННОМ ПЕРИОДИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ)
№ п/п |
Места отбора |
Показатели |
Периодичность отбора проб |
Исходная вода |
ОМЧ при температуре 37 °C Колиформы * |
1 раз в неделю |
|
Pseudomonas aeruginosa ** Клостридии *** |
1 раз в месяц |
||
Накопительный резервуар до водоподготовки |
ОМЧ при 37 °C и 22 °C |
1 раз в неделю |
|
Колиформы * |
|||
Каждый этап водоподготовки |
ОМЧ при 37 °C |
1 раз в неделю |
|
После очистки и обеззараживания |
ОМЧ при 37 °C |
1 раз в неделю |
|
Колиформы * |
|||
Готовая продукция перед розливом с каждой линии |
ОМЧ при 37 °C |
1 раз в сутки |
|
Колиформы * |
|||
ОМЧ при 22 °C |
1 раз в неделю |
||
Pseudomonas aeruginosa ** Клостридии *** |
1 раз в месяц |
||
Емкости (одноразовые) Смыв с 10 бутылок до 2 л |
ОМЧ при 37 °C |
1 раз в сутки |
|
Колиформы |
|||
Смыв с 4 бутылок 5 л |
|||
Емкости возвратные с каждой автоматической моечной машины |
ОМЧ при 37 °C |
2 раза в месяц |
|
Колиформы |
|||
Емкости возвратные после ручной мойки неделю |
ОМЧ при 37 °C |
2 раза в |
|
Колиформы |
|||
Укупорочные изделия |
ОМЧ при 37 °C |
1 раз в неделю |
|
Колиформы |
|||
Расфасованная готовая продукция через 5 дней хранения |
ОМЧ при 37 °C и 22 °C |
1 раз в неделю |
|
Колиформы * |
|||
Pseudomonas aeruginosa ** |
|||
Расфасованная готовая продукция через 1 месяц хранения |
ОМЧ при 37 °C и 22 °C |
1 раз в месяц |
|
Колиформы * |
|||
Pseudomonas aeruginosa ** |
* Колиформы — общие и глюкозоположительные колиформные бактерии.
** Pseudomonas aeruginosa определяет лаборатория, находящаяся вне территории производства; при обнаружении ОМЧ свыше допустимых норм.
*** Споры сульфитредуцирующих клостридий определяют при использовании воды поверхностного источника (автономного или
централизованного) водоснабжения или из незащищенного и малозащищенного водоносного горизонта (подрусловые, грунтовые воды, фильтрационные).
Примечания. 1. На производствах, где обеззараживание проводят на заключительном этапе водоподготовки непосредственно перед розливом, пункты 4 и 5 совпадают.
2. Пункты 5, 10, 11 относятся к каждому виду готовой продукции.
3. Частота контроля, указанная в пунктах 5, 10, может быть сокращена для производств с выпуском не более 100 бутылок в смену.
По пунктам 10 и 11: отбор проб производится 1 раз в неделю (1 раз в месяц) из емкостей, отобранных на хранение, методом случайной выборки.
Приложение 13
(обязательное)
МЕТОДИКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЕМКОСТЕЙ И УКУПОРОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ
Бактериологический контроль производят по двум показателям:
ОМЧ и колиформы.
1. Метод бактериологического контроля одноразовых емкостей
Для исследования берут 10 емкостей объемом 2,0 л и менее или 4 емкости объемом 5,0 л. Выборку емкостей осуществляет сотрудник лаборатории из каждой партии, используемой для розлива, 1 раз в неделю. Горлышко каждой бутыли должно быть закрыто стерильной фольгой.
Смывы с бутылок производят в лаборатории после обработки помещения бактерицидными лампами.
Смывы выполняет путем последовательного перелива 100 мл стерильного физиологического раствора (8,5%-ного хлористого натрия) из одной бутылки в другую после тщательного ополаскивания всей внутренней поверхности емкостей.
Из последней емкости делают посев по 1 мл смывной жидкости параллельно в 2 чашки Петри, заливают посевы мл расплавленного и охлажденного до температуры 45 °C питательного агара по общепринятой методике. Посевы инкубируют при температуре 37 °C в течениечасов.
Оставшуюся жидкость профильтровывают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, помещают на среду Эндо или засевают в глюкозопептонную среду накопления при работе титрационным методом. Посевы инкубируют при температуре 37 °C и определяют колиформные бактерии по методике Приложения 9.
Емкости могут считаться годными для розлива при отсутствии колиформных бактерий и обнаружении не более 2 КОЕ/мл ОМЧ.
2. Метод бактериологического контроля возвратных емкостей
Для исследования выбирают по 2 емкости с каждой автоматической моечной машины 2 раза в месяц. Емкости закрывают стерильной фольгой и переносят в лабораторию.
Для определения ОМЧ сливают остаточную промывную воду в стерильную посуду с соблюдением правил стерильности. Посев остаточной воды производится, как описано в методе 1 для сливной жидкости.
Для определения колиформ в одну из емкостей наливают 100 мл стерильного физиологического раствора, тщательно ополаскивают внутреннюю поверхность, переливают во вторую и после ополаскивания фильтруют через мембранный фильтр, как описано в методе 1.
При ручной мойке емкостей посев производят 2 раза в неделю.
3. Метод бактериологического контроля укупорочных изделий
Бактериологический контроль укупорочных изделий производят не реже 1 раза в месяц.
Изделия, предназначенные для укупорки одноразовых емкостей, отбирают стерильным пинцетом в количестве 10 штук в стерильную широкогорлую колбу, заливают 100 мл стерильного физиологического раствора и встряхивают в течение 5 мин. Определение ОМЧ производят, как описано в методе 1. Оставшуюся жидкость фильтруют для определения колиформ.
Изделия, предназначенные для возвратных емкостей, также отбирают стерильным пинцетом непосредственно перед укупоркой в количестве 4 штук. С помощью стерильного тампона, смоченного в 10 мл физиологического раствора, производят смыв с внутренних поверхностей последовательно всех 4 изделий, периодически смачивая тампон. Затем тампон тщательно встряхивают в течение 5 минут в этом же физиологическом растворе, отжимают вращательным движением, прижимая к стенкам пробирки, и удаляют. Производят посев на ОМЧ методом заливки, на колиформы — методом мембранной фильтрации, как это описано в методе 1.
Укупорочные изделия считаются пригодными при отсутствии колиформных бактерий и при обнаружении не более 2 КОЕ/мл ОМЧ.
Приложение 14
(обязательное)
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ОПОЛАСКИВАНИЯ ВОЗВРАТНЫХ ЕМКОСТЕЙ
Контроль качества ополаскивания возвратных емкостей, т. е. контроль на наличие остатка моющих средств, производят по изменению pH в воде, остающейся в емкостях после ополаскивания.
При использовании каустических (щелочных) препаратов контроль проводят индикатором — 0,5% фенолфталеином. Для этого остаточную воду из емкости сливают в чистую посуду и добавляют 1 — 2 капли фенолфталеинового индикатора. Окрашивание воды в розовый цвет указывает на наличие каустического моющего средства в емкостях, что требует повышения длительности и интенсивности ополаскивания.
При использовании для мытья емкостей моющих средств, не содержащих каустических соединений, качество промывки емкостей определяют по разнице pH в воде, используемой для ополаскивания, и в воде, оставшейся в емкости.
Если pH воды из вымытой емкости меньше, чем pH промывной воды, то это является доказательством присутствия моющего некаустического средства и основанием для требования проведения мероприятий по улучшению этого этапа производства расфасованной воды.
Питательные среды для стафилококков
Рецепт 60. Солевой или сахарный бульон для выделения стафилококков. 6 г хлористого натрия или 1 г глюкозы растворяют в 100 см3 мясопептонного бульона, устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °С 6,9(±0,1). Бульон разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при 121(±1) °С в течение 15 мин.
Рецепт 61. Лично-желточная взвесь (желточная эмульсия). Яично-желточная взвесь: свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ватой, смоченной в 70% спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см3 стерильного изотонического раствора хлористого натрия (физиологического раствора). Тщательно перемешивают при помощи стерильных стеклянных бус.
Желточную эмульсию готовят аналогичным образом, но берут два желтка и смешивают с 10 см3 физиологического раствора. Приготовленная эмульсия может храниться при температуре 0-5 °С не более 72 ч.
Рецепт 62. Молочно-желточно-солевой агар (МЖСА) с полимиксином для обнаружения стафилококков при исследовании воды. Сухой питательный агар—40-50 г; NaCl—90 г; вода дистиллированная—до 1000 мл. Среду расплавляют при нагревании, устанавливают pH 7,2-7,4, затем разливают в мерные сосуды и стерилизуют при 121(±1) °С в течение 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и охлажденный до 50-55 °С солевой агар добавляют (из расчета на 100 мл среды) 10 мл стерильного обезжиренного молока, 10 мл желточной смеси (один яичный желток, тщательно смешанный в асептических условиях с 50 мл изотонического раствора при помощи стеклянных бус), полимиксин М (раствор хранить не более 14 дней) 30000 ЕД. Все компоненты тщательно смешивают.
Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри толстым слоем (по 20-25 мл) для выращивания бактерий на мембранных фильтрах и тонким слоем (по 15 мл)—для подтверждающего этапа.
Рецепт 63. Яично-желточно-солевой агар. 1 дм3 мясопептонного агара перед анализом расплавляют и растворяют в нем 95 г хлористого натрия, охлаждают до температуры 45(±1) °С и добавляют 100 см3 яично-желточной взвеси. Смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Чашки хранят в холодильнике не более 5 суток.
Рецепт 64. Яично-желточно-азидный агар. 10 г пептона, 3 г хлористого натрия, 0,2 г двузамещенного фосфорно-кислого натрия, 15 г агар-агара, 5,5 г мясного экстракта растворяют при нагревании в 1 дм3 дистиллированной воды. При отсутствии мясного экстракта используют мясную воду. В этом случае все компоненты растворяют в 1 дм3 мясной воды. Устанавливают pH среды 7,6(±0,1), стерилизуют в автоклаве при 121(±1)°С в течение 30 мин, охлаждают до температуры 50-60 °С, добавляют 0,15 г азида натрия, смешивают, вновь стерилизуют при температуре 121(±1)°С в течение 30 мин, охлаждают до температуры 50 °С, добавляют 150 см3 яично-желточной взвеси, смешивают и разливают по 15 см3 в чашки Петри.
Рецепт 65. Молочно-солевой агар. Непосредственно перед посевом к 1 дм3 расплавленного и охлажденного до температуры 60-70 °С мясопептонного агара, содержащего 65 г хлористого натрия, добавляют 100 см3 стерильного обезжиренного молока. Устанавливают pH 7,4(±0,1), тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.
Рецепт 66. Байрд-Паркер агар. Основа среды: в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона или пептона, 17,9 г хлористого лития 6-водного, 5 г мясного экстракта и 5 см3 (или 1 г) дрожжевого экстракта, 20 г агар-агара.
При отсутствии мясного экстракта вместо дистиллированной воды и мясного экстракта используют 1 дм3 мясной воды или бульона Хоттингера либо 1 дм3 мясопептонного бульона. При использовании мясопептонного бульона триптон или пептон в среду не вносят.
Все компоненты, внесенные в 1 дм3 дистиллированной воды (мясопептонного бульона или бульона Хоттингера), нагревают, помешивая до полного растворения, охлаждают до 50-60 °С. Устанавливают pH 6,8-7,0, разливают в колбы по 90 см3 и стерилизуют в автоклаве при 121(±1) °С в течение 20 мин. К 90 см3 расплавленной и охлажденной основы среды добавляют асептически 5 см3 желточной эмульсии и стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см3 раствора глицина концентрации 200 г/дм3, 5 см3 раствора пирувата натрия концентрации 200 г/дм3 и 1 см3 раствора теллурита калия концентрации 10 г/дм3.
После тщательного перемешивания готовую среду разливают в стерильные чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.
Рецепт 67. Среда с ДНК (для выявления термостабильной нуклеазы). Растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды 6,1 г трисаминометана и доводят pH раствора до 9,0(±0,1).
К раствору добавляют 0,3 г ДНК, 10 г хлористого натрия, 1,1 см3 раствора хлористого кальция концентрации 1 г/дм3, 15 г агар-агара и нагревают смесь до полного расплавления агара. К охлажденной до 65-55 °С среде добавляют 9,2 см3 водного раствора толуидина синего «С» концентрации 10 г/дм3, тщательно перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри. Допускается хранение среды при температуре 6(±2)°С не более 7 суток.
— Вернуться в оглавление раздела «Медицинская микробиология»
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.10.2019
НОВОСТИ БИБЛИОТЕКА КАРТА САЙТА О САЙТЕ
Глава 14. Стафилококки
Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).
Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle — виноградная гроздь) имеют вид круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде грозди винограда. Такая форма является результатом деления микробов в различных плоскостях. Однако в гное встречаются единичные и парные кокки. Стафилококки неподвижны, не имеют спор, при специальных условиях культивирования образуют микрокапсулу, грамположительны.
Культивирование. Стафилококки — факультативные анаэробы, однако лучше растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных средах, хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия — температура 37° С, рН 7,2-7,4.
Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.
Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.
Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.
Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.
Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу, разрушающую пенициллин.
Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-токсин. Он обладает следующими свойствами: гемолитическим — вызывает гемолиз эритроцитов, дермонекротическим — при внутрикожном введении вызывает некроз, летальным — при внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему животных.
Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты, энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.
Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.
Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.
Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40 фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).
Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.
Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека
Примечание. + наличие ферментации, устойчивости, — отсутствие ферментации, устойчивости.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах обихода. При температуре 100° С они погибают моментально, при температуре 70° С — через 10-15 мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При замораживании сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо переносят высушивание. Прямой солнечный свет убивает их только через несколько часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ (например, сулема в разведении 1:1000) убивают их через 15-20 мин. При обезвреживании выделений, содержащих гной, белок, мокроту, не следует применять фенол. Это дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что предохраняет микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к бриллиантовому зеленому.
Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных — кролики, белые мыши и котята.
Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.
Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой, пищевой.
Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы, остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм стафилококковой этиологии.
Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.
Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет золотистый стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S. epidermidis и S. saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя — ферментами, экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием иммунной системы макроорганизма.
Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка — возникают пиодермиты, фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные заболевания, например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые инфекции. Особенно велика роль стафилококков в акушерской практике, так как новорожденные очень чувствительны к ним. В течении стафилококковых заболеваний имеет значение развитие аллергии, поэтому заболевание характеризуется рецидивами.
Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой, поносом, головной болью и другими явлениями.
Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.
Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому наблюдаются рецидивы.
Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий, активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы больничных учреждений.
Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин.
Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.
Контрольные вопросы
1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?
2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?
3. Какие заболевания вызывают стафилококки?
4. Какие виды стафилококков Вы знаете?
Микробиологическое исследование
Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.
Материал для исследования
1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).
2. Слизь из зева (ангина).
3. Мокрота (пневмония).
4. Моча (пиелиты и циститы).
5. Дуоденальное содержимое (холецистит).
6. Кровь (подозрение на сепсис).
7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые отравления).
8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).
Способы сбора материала
Способы сбора материала
Основные методы исследования
1. Микроскопический.
2. Микробиологический.
3. Биологический.
Ход исследования Первый день исследования
Первый день исследования
Все посевы ставят в термостат на сутки.
Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.
Второй день исследования
Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы, которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.
При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.
Третий день исследования
Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной культуры:
а) ставят реакцию плазмокоагуляции;
б) изучают гемолитические свойства;
в) определяют продукцию ДНКазы;
г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;
д) определяют устойчивость к новобиоцину.
Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке консистенция плазмы не изменяется.
Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых обследованиях.
Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только эритроциты барана).
Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не образуется.
Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).
Четвертый день исследования
Производят учет результатов (табл. 24).
Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка
Примечание. + положительная реакция.
Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен S. aureus (рис. 37).
Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка
Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков, выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.
Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов. Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.
Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.
Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через 6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса производят через 18-24 ч.
Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2 мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует о наличии летального действия токсина.
Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется инфильтрат, сопровождающийся некрозом.
Реакцию учитывают через 24-18 ч.
Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).
1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?
2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления стафилококков?
3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?
4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?
5. С какой целью проводят фаготипирование?
Задание
Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура стафилококка.
Питательные среды
Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки.
Агар с кровью. См. главу 7.
Солевой бульон, солевой агар. Готовят как обычные среды — МПБ и МПА, только натрия хлорид вносят в большем количестве (8-10%). Бульон разливают в колбы, пробирки, агар — в чашки.