Реакция торможения гемагглютинации

51. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.

• •1.Медицинская микробиология. Предмет, задачи, методы, связь с другими науками. Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача.
• •3. Микроорганизмы и их положение в системе живого мира. Номенклатура бактерий. Принципы классификации.
• •6. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
• •7.Питание бактерий. Типы и механизмы питания бактерий. Аутотрофы и гетеротрофы. Факторы роста. Прототрофы и ауксотрофы.
• •8.Питательные среды. Искусственные питательные среды: простые, сложные, общего назначения, элективные, дифференциально-диагностические.
• •9. Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
• •13. Спирохеты, их морфология и биологические свойства. Патогенные для человека виды.
• •14. Риккетсии, их морфология и биологические свойства. Роль риккетсий в инфекционной патологии.
• •15. Морфология и ультраструктура микоплазм. Виды, патогенные для человека.
• •16. Хламидии, морфология и другие биологические свойства. Роль в патологии.
• •17. Грибы, их морфология и особенности биологии. Принципы систематики. Заболевания, вызываемые грибами у человека.
• •20. Взаимодействие вируса с клеткой. Фазы жизненного цикла. Понятие о персистенции вирусов и персистентных инфекциях.
• •21. Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов.
• •24. Строение генома бактерий. Подвижные генетические элементы, их роль в эволюции бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды изменчивости: фенотипическая и генотипическая.
• •25. Плазмиды бактерий, их функции и свойства. Использование плазмид в генной инженерии.
• •26. Генетические рекомбинации: трансформация, трансдукция, конъюгация.
• •27. Генная инженерия. Использование методов генной инженерии для получения диагностических, профилактических и лечебных препаратов.
• •28.Распространение микробов в природе. Микрофлора почвы, воды, воздуха, методы ее изучения. Характеристика санитарно-показательных микроорганизмов.
• •29. Нормальная микрофлора тела человека, ее роль в физиологических процессах и патологии. Понятие о дисбактериозе. Препараты для восстановления нормальной микрофлоры: эубиотики (пробиотики).
• •30. Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Понятие об источниках инфекции, механизмах, путях и факторах передачи.
• •31. Формы проявления инфекции. Персистенция бактерий и вирусов. Понятие о рецидиве, реинфекции, суперинфекции.
• •32. Динамика развития инфекционного процесса, его периоды.
• •33. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность. Единицы измерения вирулентности. Понятие о факторах патогенности.
• •34. Классификация факторов патогенности по о.В. Бухарину. Характеристика факторов патогенности.
• •35. Понятие об иммунитете. Виды иммунитета.
• •36. Неспецифические защитные факторы организма против инфекции. Роль и.И. Мечникова в формировании клеточной теории иммунитета.
• •37. Антигены: определение, основные свойства. Антигены бактериальной клетки. Практическое использование антигенов бактерий.
• •38. Структура и функции иммунной системы. Кооперация иммунокомпетентных клеток. Формы иммунного ответа.
• •39. Иммуноглобулины, их молекулярная структура и свойства. Классы иммуноглобулинов. Первичный и вторичный иммунный ответ. :
• •40. Классификация гиперчувствительности по Джейлу и Кумбсу. Стадии аллергической реакции.
• •41. Гиперчувствительность немедленного типа. Механизмы возникновения, клиническая значимость.
• •42. Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения. Механизм. Их предупреждение.
• •43. Гиперчувствительность замедленного типа. Кожно-аллергические пробы и их использование в диагностике некоторых инфекционных заболеваний.
• •44. Особенности противовирусного, противогрибкового, противоопухолевого, трансплантационного иммунитета.
• •45. Понятие о клинической иммунологии. Иммунный статус человека и факторы, влияющие на него. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.
• •46. Первичные и вторичные иммунодефициты.
• •47. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Теория сетевых структур.
• •48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.
• •49. Реакция Кумбса. Механизм. Компоненты. Применение.
• •50. Реакция пассивной гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.
• •51. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.
• •53. Реакция связывания комплемента. Механизм. Компоненты. Применение.
• •54. Реакция нейтрализации токсина антитоксином, нейтрализации вирусов в культуре клеток и в организме лабораторных животных. Механизм. Компоненты. Способы постановки. Применение.
• •55. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм. Компоненты. Применение.
• •56. Иммуноферментный анализ. Иммуноблотинг. Механизмы. Компоненты. Применение.
• •57. Вакцины. Определение. Современная классификация вакцин. Требования, предъявляемые к вакцинным препаратам.
• •59. Вакцинопрофилактика. Вакцины из убитых бактерий и вирусов. Принципы приготовления. Примеры убитых вакцин. Ассоциированные вакцины. Преимущества и недостатки убитых вакцин.
• •60. Молекулярные вакцины: анатоксины. Получение. Использование анатоксинов для профилактики инфекционных заболеваний. Примеры вакцин.
• •61. Генно-инженерные вакцины. Получение. Применение. Преимущества и недостатки.
• •62. Вакцинотерапия. Понятие о лечебных вакцинах. Получение. Применение. Механизм действия.
• •63. Диагностические антигенные препараты: диагностикумы, аллергены, токсины. Получение. Применение.
• •64. Сыворотки. Определение. Современная классификация сывороток. Требования, предъявляемые к сывороточным препаратам.
• •65. Антительные препараты – сыворотки, применяемые для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Способы получения. Осложнения при применении и их предупреждение.
• •66. Антительные препараты – сыворотки, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний. Способы получения. Применение.
• •67. Понятие об иммуномодуляторах. Принцип действия. Применение.
• •68. Интерфероны. Природа, способы получения. Применение. № 99 Интерфероны. Природа, способы получения. Применение.
• •69. Химиотерапевтические препараты. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Основные группы химиотерапевтических препаратов, механизм их антибактериального действия.
• •71. Лекарственная устойчивость микроорганизмов и механизм ее возникновения. Понятие о госпитальных штаммах микроорганизмов. Пути преодоления лекарственной устойчивости.
• •72. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней.
• •73. Возбудители брюшного тифа и паратифов. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •74. Возбудители эшерихиозов. Таксономия. Характеристика. Роль кишечной палочки в норме и патологии. Микробиологическая диагностика эшерихиозов.
• •75. Возбудители шигеллеза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •76. Возбудители сальмонеллезов. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологический диагноз сальмонеллезов. Лечение.
• •77. Возбудители холеры. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профи­лактика и лечение.
• •78.Стафилококки. Таксономия. Характеристика. Микроби­ологическая диагностика заболеваний, вызываемых ста­филококками. Специфическая профилактика и лечение.
• •79. Стрептококки. Таксономия. Характеристика. Микро­биологическая диагностика стрептококковых инфек­ций. Лечение.
• •80. Менингококки. Таксономия. Характеристика. Микро­биологическая диагностика стрептококковых инфек­ций. Лечение.
• •81. Гонококки. Таксономия. Характеристика. Микробио­логическая диагностика гонореи. Лечение.
• •82. Возбудитель туляремии. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологическая диагностика. Специфическая про­филактика и лечение.
• •83. Возбудитель сибирской язвы. Таксономия и характе­ристика. Микробиологическая диагностика. Специфичес­кая профилактика и лечение.
• •84. Возбудитель бруцеллеза. Таксономия и характерис­тика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •85. Возбудитель чумы. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профи­лактика и лечение.
• •86. Возбудители анаэробной газовой инфекции. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •87. Возбудители ботулизма. Таксономия и характеристика Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •88. Возбудитель столбняка. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика и лечение.
• •89. Неспорообразующие анаэробы. Таксономия. Характе­ристика. Микробиологическая диагностика и лечение.
• •90. Возбудитель дифтерии. Таксономия и характеристика. Условно – патогенные коринебактерии. Микробиологическая диагностика. Выявления анатоксического иммунитета. Специфическая профилактика и лечение.
• •91. Возбудители коклюша и паракоклюша. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •92. Возбудители туберкулеза. Таксономия и характеристика. Условно – патогенные микобактерии. Микробиологическая диагностика туберкулеза.
• •93. Актиномицеты. Таксономия. Характеристика. Мик­робиологическая диагностика. Лечение.
• •95. Возбудитель хламидиозов. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологическая диагностика. Лечение.
• •96.Возбудитель сифилиса. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Лечение.
• •97. Возбудитель лептоспирозов. Таксономия. Характери­стика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика. Лечение.
• •98. Возбудитель боррелиозов. Таксономия. Характерис­тика. Микробиологическая диагностика.
• •99. Клиническая микробиология , ее задачи. Вби, особенности причины возникновления.Роль условно – патогенных микроорганизмов в возникновении внутрибольничных инфекций.
• •100. Классификация грибов. Характеристика. Роль в патологии. Лабораторная диагностика. Лечение.
• •101. Классификация микозов. Поверхностные и глубокие микозы. Дрожжеподобные грибы рода кандида. Роль в патологии человека.
• •102. Возбудитель гриппа. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилакти­ка и лечение.
• •103. Возбудитель полиомиелита. Таксономия и характери­стика. Лабораторная диагностика. Специфическая про­филактика.
• •104. Возбудители гепатитов а и е. Таксономия. Характе­ристика. Лабораторная диагностика. Специфическая про­филактика.
• •105. Возбудитель клещевого энцефалита. Таксономия. Ха­рактеристика. Лабораторная диагностика. Специфичес­кая профилактика.
• •106. Возбудитель бешенства. Таксономия. Характеристи­ка. Лабораторная диагностика. Специфическая профи­лактика.
• •107. Возбудитель краснухи. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилак­тика.
• •108. Вирус кори. Таксономия. Характеристика. Лабора­торная диагностика. Специфическая профилактика.
• •109. Возбудитель эпедимического паротита. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика.
• •V.Клиника
• •I.Эпидемиология
• •110. Герпес-инфекция: таксономия, характеристика воз­будителей. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• •111. Возбудитель натуральной оспы. Таксономия. Харак­теристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика оспы на современном этапе
• •112. Возбудители гепатитов в, с, d. Таксономия. Характерис­тика. Носительство. Лабораторная диагностика. Специфи­ческая профилактика.
• •113. Вич-инфекция. Таксономия, характеристика возбудителей. Лабораторная диагностика, профилактика.

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

РИГА применяют в двух вариантах: с известными АГ для обнаружения АТ с известными АТ для выявления АГ. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для проведения РИГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах АГ или АТ — в зависимости от цели исследования (рис. 10.3). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

Рис. 10.3. РИГА (по Бургасовой, Безденежных,1969):

1 — эритроциты, 2 — АГ эритроцита, 3 — конъюгированный АГ, 4—АТ

РГА и реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

Как уже отмечалось, в основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных АГ. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической реакцией, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения АГ для постановки РТГА или наличия АГ (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека с I (0) группой крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5%-й взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1—2 мин макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистироловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25—1%-й взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов, соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью РТ ГА типоспецифическими сыворотками. РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными АТ вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования АТ в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус, и по одной капле 1%-й взвеси эритроцитов. При использовании РТГА для определения типа вируса используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения АГ. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр АТ к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевого энцефалита, гриппа и др.) в целях обнаружения специфических АТ и для идентификации многих вирусов по их АГ.

Техника постановки РТГА.

Проведение РТГА включает следующие этапы:

-определение рабочей дозы вирусного диагностикума; постановка основного опыта.

На первом этапе титруется вирусный диагностикум в РГА по методике, описанной выше.

Определяется одна гемагглютинирующая единица (1 ГАЕ), составляющая то наибольшее разведение, при котором четко выражена агглютинация эритроцитов не менее чем на 2+. Для основного опыта используется 4 ГАЕ. Для этого показатель титра в 1 ГАЕ делят на 4. Так, если 1 ГАЕ составила титр 1:256, то рабочее разведение для РТГА будет равно 1:64. Достоверность расчетов и подбора рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) определяют постановкой РГА.

В процессе проведения основного опыта РТГА, используя ФБР готовят последовательные двойные разведения исследуемых проб сыворотки крови, которые ранее были освобождены от ингибиторов и изогемагглютининов. Для этого в каждую лунку микроплашки вносят по 1 капле ФБР, а затем в каждую первую лунку — по 1 капле исследуемой сыворотки крови. После 3-кратного пипетирования из первой лунки 1 каплю переносят во вторую и т.д. Из последней лунки 1 каплю удаляют в дезраствор. В дальнейшем во все лунки вносят по 1 капле вирусного диагностикума, содержащего 4 ГАЕ.

Плашки осторожно, но тщательно встряхивают и после часового контакта сыворотки с атигеном в каждую лунку добавляют по 2 капли 0,5%-ной взвеси эритроцитов, снова осторожно встряхивают плашки и оставляют их при комнатной температуре в течение часа, а если необходимо, дополнительно выдерживают при 4°С в течение 16—18 часов. Основанием для проведения учета результатов реакции считается полное оседание эритроцитов в контролях:

контроль рабочей дозы вируса (4 ГАЕ); контроль эритроцитов на самоагглютинацию; контроль испытуемой сыворотки; контроль 4 ГАЕ с нормальной сывороткой; контроль 4 ГАЕ со специфической сывороткой.

Диагностическим титром, когда сыворотка считается положительной является разведение ее 1:32 и выше, где установлено торможение агглютинации эритроцитов не менее чем 2+.

Анализируя эффективность при использовании РГА и РТГА в диагностике коронавирусного энтерита, уместно напомнить о том, что указанные тесты могут быть с успехом применены и для диагностики ротавирусной инфекции по описанным выше методикам, но при использовании эритроцитов морской свинки или нулевой группы человека.

При экспресс-изучении эпизоотической ситуации по отдельному хозяйству следует провести исследование проб сыворотки крови больных (не мене 10% животных) и клинически здоровых новорожденных телят, подобранных по принципу аналогов. В этом случае принимают во внимание тот факт, что телята должны быть получены от неиммунных коров, при наличии характерных симптомов болезни и разности в титрах антител не менее чем в 3—4 раза между указанными группами животных, можно решить вопрос по диагностике болезни.

Ретроспективная диагностика предусматривает выявление прироста титра специфических антител в парных пробах сыворотки крови с помощью РТГА, РН, ИФА.

Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев:

-при выявлении вируса, выделенного из исходного материала в культуре клеток, вызывающего специфический ЦПЭ с последующей иден- тификацией в РН, РТГА и ИФА;

-при индикации вирионов с характерной морфологией в исследуемом материале методом иммуноэлектронной микроскопии;

-при обнаружении коронавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобов со слизистой оболочки в РИФ, ИФА и РИД при наличии характерных клинических и патологоанатомических показателей, с учетом эпизоотической обстановки;

-при 3—4 кратном увеличении титра антител во второй пробе сыворотки крови в сравнении с первой при ретроспективной диагностике.

В процессе проведения дифференциальной диагностики необходимо исключить ротавирусную и аденовирусную инфекции, сальмонеллез, стрептококкоз, анаэробную энтеротоксемию, криптоспоридиоз, а также незаразные болезни, сопровождающиеся поражением желудочно-кишечного тракта.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (определение серотипа вируса гриппа А)

РТГА относится к реакциям нейтрализации in vitro.

Механизм. У некоторых вирусов (например, вируса гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных в зависимости от вида вируса. При наличии в сыворотке антител – антигемагглютининов наблюдается ингибированные гемагглютинирующей активности вирусов (рис.32).

Компоненты.

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость куриного эмбриона;

2) диагностические противогриппозные сыворотки с антителами против серотипов вируса гриппа А: А(Н1N1), А(Н2N2), А(Н3N2 и др.;

3) 3,5% взвесь куриных эритроцитов – индикатор реакции;

4) физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной – выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

9.8 Реакции связывания комплемена: РСК Борде-Жангу, РСК,

Вассермана, РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемы

Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам – гемолизинами и т.д.

Лизины способны проявить свое лизирующее действие на АГ только в присутствии комплемента, который является составной частью любой свежей сыворотки.

Таким образом, в основе реакции лизиса (РСК) лежит взаимодействие трех компонентов:

1) АГ (бактериальных клеток, эритроцитов, вирусов и др.);

2) специфических АТ иммунной сыворотки (бактериолизинов, гемолизинов и др.);

3) комплемента (сыворотка морской свинки).

В начале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ-АТ через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Наступает активация компонентов комплемента, которая приводит к потери подвижности бактерий (р. иммобилизации трепонем — при сифилисе), изменению формы (набухают), и, наконец, совсем растворяются (р. агглютинации-лизиса при лептоспирозе, р. лизиса — при возвратном тифе).

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:

1) серологической диагностики (определения противомикробных антител) инфекционных заболеваний (р. Вассермана, Борде-Жангу и др.)

2) идентификации бактерии и др. микробов. Например, реакция бактериолизиса (РСК) применяется при холере с целью идентификации вибрионов.

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

первая система (тестовая) – инкубация смеси, содержащей АГ-АТ-комплемент;

вторая система (индикаторная) – гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент), во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (рис.33).

Для постановкиРСК Борде-Жангу,которая применяется с цельюопределения антител к гонококку (N. gonorrhoeae) при хронической гонореи требуются следующие компоненты:

1.Компоненты тестовой системы:

1) испытуемая сыворотка неизвестными противогонококковыми антителами (предварительно инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 минут);

2) гонококковый диагностикум– взвесь убитых N. gonorrhoeae; ;

3) комплемент;

2.Индикаторная (гемолитическая) система:

1) 3% взвесь эритроцитов барана (корпускулярный антиген-агглютиноген);

2) гемолитическая сыворотка;

3.физиологический раствор.

В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше титра на 25%.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56°С, определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

РСК Вассерманаставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения противотрепанемных антител в сыворотке крови, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является применение двух диагностикумов — перекрестнореагирующих антигенов № 1 и № 2:

— диагностикум № 1 – специфический, трепонемный (взвесь убитых Tr. рallidum);

— диагностикум №2 – неспецифический, кардиолипиновый антиген (собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца).

Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведомо положительной сыворотками.

Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50% больных реакция становится положительной не ранее чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Во втором и третьем периодах сифилиса частота положительных реакций достигает 75-90%. После проведенного курса лечения реакция Вассермана становится отрицательной.

Реакция может быть ложноположительной при ряде заболеваний и состояний: беременность, онкопроцессы, туберкулез, после приема жирной пищи и алкоголя и др.

Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса можно ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.

РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемыприменяется для серологичекой диагностики сифилиса, то есть определения противотрепанемных антител в сыворотке кров. РИБТ позволяет дифференцировать биологически ложноположительные результаты реакции Вассермана и осадочных реакций от истинных, что делает ее незаменимой при распознавании скрытого сифилиса, диагноз которого может быть поставлен часто лишь на основании серологических исследований.

Ингредиенты:

· испытуемая сыворотка с противотрепанемными антителами (иммобилизины);

· антиген — взвесь бледных трепонем, полученный из яичка кролика зараженного сифилитическим орхитом;

· комплимент – сыворотка морских свинок в рабочей дозе;

В основе реакции лежит образование иммунного комплекса АГ-АТ-комплемент, что сопровождается активацией последнего и потерей подвижности T.рallidum. Учет реакции проводится микроскопированием препарата «раздавленной» капли.

4. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

5 Реакция нейтрализации вирусов. Данная реакция используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если антитела соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается, и индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним.

2.Реакция гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации, их диагностическое значение при инфекциях.

• •Экзаменационные билеты лечебного факультета по микробиологии с ответами (2014) экзаменационный билет № 1
• •2.Основные исторические этапы развития микробиологии, вклад отечественных и зарубежных ученых. Разделы микробиологии.
• •3.В лабораторию поступила мокрота больного с патологическим процессом в легких. Наметить план лабораторных исследований.
• •Экзаменационный билет № 2
• •1. Стрептококки и заболевания, вызываемые ими.
• •2.Основные исторические этапы развития вирусологии, вклад отечественных и зарубежных ученых в ее развитие. Разделы вирусологии.
• •Экзаменационный билет № 3
• •1.Пневмококки и заболевания, вызываемые ими.
• •2. Космическая микробиология и гнотобиология (цели, задачи, достижения и их применение в медицине).
• •3.Наметить план бактериологического обследования работников кондитерской фабрики для выявления возможного бактерионосительства, опасного для производства.
• •Экзаменационный билет № 4
• •1. Менингококки и менингококковая инфекция.
• •2.Значение микробиологии, вирусологии в деятельности врача.
• •3.В стационаре у ребенка с диагнозом “Острая бронхопневмония” обнаружена дисфункция кишечника. Как установить этиологию патологии? Каковы причины кишечной патологии?
• •Экзаменационный билет № 5
• •2.Основные принципы классификации микробов и их номенклатура. Понятие о штамме, клоне, культуре, колонии микроорганизмов.
• •3. С какого дня болезни следует проводить серологические исследования при брюшном тифе у детей и взрослых? Какие титры агглютининов считают в этих случаях диагностическими?
• •Экзаменационный билет № 6
• •1.Псевдомонада – синегнойная палочка, ее роль в патологии человека.
• •2.Основные принципы классификации вирусов (генетическая, структурная, органотропная систематика). Понятие о ретровирусах, дефектных вирусах.
• •Экзаменационный билет № 7
• •1.Эшерихии и эшерихиозы.
• •3.У больного, поступившего в стационар с диагнозом “Пищевая токсикоинфекция”, резко нарастают явления обезвоживания. Как, с помощью каких методов, можно установить причину?
• •Экзаменационный билет № 8
• •1.Сальмонеллы и сальмонеллезы – брюшной тиф, паратифы.
• •2.Временные структурные элементы бактериальной клетки (споры, капсулы), их функциональное значение и обнаружение.
• •Экзаменационный билет № 9
• •1. Пищевые токсикоинфекции и их возбудители.
• •2.Подвижность микроорганизмов, органеллы движения и методы определения (прямые, косвенные). Примеры непостоянства движения при наличии органелл.
• •Экзаменационный билет № 10
• •1.Шигеллы и шигеллезы.
• •2.Спирохеты, классификация, особенности выявления.
• •3.Реакция Хеддельсона с сывороткой крови больного в объеме 0,2 мл
• •Экзаменационный билет № 11
• •1.Клебсиеллы и заболевания, вызываемые ими (очаговая пневмония, риносклерома).
• •2.Вирусы, структура вириона, выявление.
• •Экзаменационный билет № 12
• •1. Иерсинии, возбудитель чумы.
• •2.Понятие о прионах.
• •3.На прибывшем в порт судне обнаружены трупы грызунов. Наметить план лабораторной индикации возбудителя, противоэпидемических мероприятий.
• •Экзаменационный билет № 13
• •1.Иерсинии, возбудитель псевдотуберкулеза.
• •2.Грибы, классификация, патогенные и условно-патогенные виды, методы выявления.
• •Экзаменационный билет № 14
• •1.Yersinia enterocolitica, роль в патологии.
• •2.Патогенные простейшие, классификация, биологические свойства, методы выявления.
• •Экзаменационный билет № 15
• •1.Холера и холерные вибрионы (классический холерный, Эль-Тор, о139).
• •2.Тинкториальные свойства микроорганизмов, сущность, дифференциально-диагностическое значение, определение методами Грама и Циль-Нильсена.
• •3.Каковы профилактические и лечебные мероприятия при поступлении в стационар больного с бактериологически подтвержденным диагнозом “ботулизм”.
• •Экзаменационный билет № 16
• •1. Пищевые интоксикации (стафилококковые, ботулизм и пр.).
• •2.Размеры микробной клетки, особенности у разных таксономических групп. Способы определения.
• •Экзаменационный билет № 17
• •1. Бруцеллы и бруцеллез.
• •2.Питание микробов, его виды, механизмы, пластический обмен.
• •Экзаменационный билет № 18
• •1.Туляремия и ее возбудитель.
• •2.Лабораторное обеспечение питания микробов. Питательные среды, сущность их конструирования, виды, назначение, контроль.
• •Экзаменационный билет № 19
• •1.Бордетеллы и бордетеллиозы (коклюш и паракоклюш).
• •2.Дыхание микробов, его варианты, сущность, механизмы аэробного и анаэробного дыхания, определение типа.
• •3.Как оценить положительную реакцию Вассермана со специфическим спирохетозным антигеном, положительные риф, рит у беременных на 8, 12, 24 неделях беременности?
• •Экзаменационный билет № 20
• •1. Особо опасный бациллез – сибирская язва.
• •2.Методы культивирования анаэробов в лабораторных условиях.
• •Экзаменационный билет № 21
• •1.Патогенные клостридии и возбудители раневого анаэробиоза – газовой гангрены, условия развития
• •2.Культуральные свойства микроорганизмов, их своеобразие у различных видов и обеспечение в лабораторных условиях.
• •Экзаменационный билет № 22
• •1.Патогенные клостридии и возбудитель раневого анаэробиоза – столбняка.
• •2.Размножение микробов, фазы роста.
• •3.В стационар поступил ребенок с диагнозом “Острое респираторное заболевание”. Как, используя микробиологические методы, уточнить этиологию заболевания? Что можно заподозрить?
• •Экзаменационный билет № 23
• •1.Патогенные клостридии и возбудители ботулизма.
• •2.Биохимическая активность микроорганизмов, ее определение и дифференциально-диагностическое значение.
• •Экзаменационный билет № 24
• •1.Листерии и листериозы.
• •2.Понятие о патогенности, вирулентности, единицы ее измерения. Пути повышения и снижения вирулентности патогенных микробов, практическое значение в медицине. Примеры.
• •Экзаменационный билет № 25
• •1.Коринобактерии и коринобактериозы
• •2.Факторы патогенности микробов, их выявление.
• •3.Из носоглоточного смыва больного выделена чистая культура золотистого стафилококка. Всегда ли можно утверждать, что она причина болезни. Как доказать, что данный штамм – возбудитель заболевания?
• •Экзаменационный билет № 26
• •1.Патогенные микобактерии – возбудители туберкулеза.
• •3.Из желчи переболевшего брюшным тифом выделен возбудитель названного заболевания. Как оценить данную ситуацию? Болен ли человек в настоящее время?
• •Экзаменационный билет № 27
• •1. Патогенные микобактерии, возбудитель лепры.
• •2.Особенности культивирования, выделения и идентификации чистой культуры анаэробов.
• •3.Из организма практически здорового человека выделен заведомо патогенный вид микроба. О чем это свидетельствует? Почему возбудитель болезни присутствует в организме, а заболевание не проявляется?
• •Экзаменационный билет № 28
• •1. Патогенные актиномицеты и актиномикозы.
• •2.Репродукция вирусов, особенности ее обеспечения в лабораторных условиях. Методы культивирования вирусов.
• •1.Патогенные спирохеты, сифилис.
• •2.Антигены, их виды и материальная основа, функции, определение. Назначение в практической медицине вакцин, диагностикумов.
• •3.У двух реконвалесцентов проведены бактериологические исследования. У одного возбудитель не обнаружен, у другого – выявлен. Как оценить исход заболевания? с чем это может быть связано?
• •Экзаменационный билет № 30
• •1.Патогенные спирохеты – возбудители бореллиозов (эндемического и эпидемического возвратного тифа).
• •2.Понятие об “о”, “н”, “к”-антигенах, аутоантигенах, изоантигенах организма. Примеры.
• •3.В детскую инфекционную больницу поступил ребенок с диагнозом “дифтерия”, “скарлатина”. Как уточнить этиологию заболевания? Возможно ли сочетание этих инфекций?
• •Экзаменационный билет № 31
• •1.Патогенные спирохеты – возбудители лептоспирозов.
• •2. Токсины и ферменты, как антигены.
• •3.У больного гриппом выявлена пневмония, вызванная стафилококком. Как называется такая форма инфекции? Объясните причины ее возникновения. Приведите другие примеры такого сочетания.
• •Экзаменационный билет № 32
• •1.Патогенные риккетсии и эпидемический сыпной тиф.
• •2.Антитела, их виды, материальная основа, функции.
• •3.В хирургическом отделении возникла серия гнойных послеоперационных осложнений. Наметить план выявления источника инфекции, выделения возбудителя и связи его с ним.
• •Экзаменационный билет № 33
• •1.Патогенные риккетсии и эндемический сыпной тиф.
• •2.Иммуноглобулины основных классов, структурные и функциональные особенности, динамика биосинтеза, значение при инфекционных заболеваниях.
• •3.Крышка на банке с заготовленными впрок грибами вздулась. Наметить план обнаружения причины порчи продукта.
• •Экзаменационный билет № 34
• •1. Патогенные микоплазмы и заболевания вызываемые ими
• •2.Современные представления о механизмах и сущности антителообразования. Роль антигена в антителогенезе.
• •3.Микробное число в пробе колодезной воды 15 мт/мл, коли-индекс равен 2, обнаружен вибрион Эль-Тор. Дать заключение пригодности воды данного источника.
• •Экзаменационный билет № 35
• •1.Патогенные хламидии и хламидиозы (трахома, урогенитальный, респираторный хламидиоз).
• •2.Убитые вакцины и техника их приготовления; контроль.
• •3.Коли-титр воды открытого водоема 550 мл, из нее выделен брюшнотифозный бактериофаг в высоком титре. Пригодна ли вода данного водоема в качестве питьевой?
• •Экзаменационный билет № 36
• •1. Поксвирусы. Натуральная оспа и ее возбудитель.
• •2.Химические вакцины, виды, способы приготовления.
• •Экзаменационный билет № 37
• •1. Герпесвирусы. Вирусы простого герпеса (впг).
• •Экзаменационный билет № 38
• •1. Герпесвирусы. Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса.
• •2.Анатоксин, его приготовление, назначение, определение силы и качества, контроль.
• •3.С какого дня болезни следует проводить серологические исследования при брюшном тифе у детей и взрослых? Какие титры агглютининов считают в этих случаях диагностическими?
• •Экзаменационный билет № 39
• •1. Герпесвирусы. Вирус Эпштейна-Барр, вирус цитомегалии.
• •2.Понятие о поливакцинах. Условия, определяющие эффективность иммунопрофилактики.
• •Экзаменационный билет № 40
• •1. Коронавирусы. Sars.
• •2.Вакцинопрофилактика и вакцинотерапия. Основные принципы их использования. Аутовакцины, приготовление, контроль качества, назначение.
• •3. У больного, поступившего в стационар с диагнозом “Пищевая токсикоинфекция”, резко нарастают явления обезвоживания. Как, с помощью, каких методов, можно установить причину?
• •Экзаменационный билет № 41
• •1.Тогавирусы. Вирус краснухи.
• •2.Живые вакцины, методы аттенуации вакцинных штаммов и особенности их применения.
• •Экзаменационный билет № 42
• •1. Паповавирусы. Папилломавирусы человека
• •2.Реакция агглютинации, сущность, техника, варианты, применение.
• •Экзаменационный билет № 43
• •2.Реакция гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации, их диагностическое значение при инфекциях.
• •3.Реакция Хеддельсона с сывороткой крови больного в объеме 0,2 мл
• •Экзаменационный билет № 44
• •1.Ортомиксовирусы. Вирус гриппа и грипп.
• •2.Реакция гемадсорбции и реакция торможения гемадсорбции, их диагностическое значение при вирусных инфекциях.
• •Экзаменационный билет № 45
• •1.Парамиксовирусы. Парагриппозные вирусы и их роль в возникновении острых респираторных заболеваний.
• •2.Реакция связывания комплемента, сущность, техника, варианты, применение. Примеры.
• •3.На прибывшем в порт судне обнаружены трупы грызунов. Наметить план лабораторной индикации возбудителя, противоэпидемических мероприятий.
• •Экзаменационный билет № 46
• •1. Парамиксовирусы. Эпидемический паротит и его возбудитель.
• •2.Неполные (блокирующие) антитела и их определение в реакции торможения связывания комплемента, сущность, техника, особенности учета.
• •Экзаменационный билет № 47
• •1. Парамиксовирусы. Корь и ее возбудитель.
• •2.Реакция преципитации, сущность, техника, варианты, применение.
• •Экзаменационный билет № 48
• •1. Рабдовирусы. Бешенство и его возбудители.
• •2.Особенности вирусных инфекций. Роль вирусной нуклеиновой кислоты, белков, токсических веществ в инфекционном процессе. Понятие о дефектных вирусах.
• •2. Каковы профилактические и лечебные мероприятия при поступлении в стационар больного с бактериологически подтвержденным диагнозом “ботулизм”.
• •Экзаменационный билет № 49
• •1.Пикорнавирусы. Полиомиелит и его возбудители.
• •2.Реакция нейтрализации токсина антитоксином: сущность, техника, варианты, применение in vitro и in vivo.
• •Экзаменационный билет № 50
• •1.Флавивирусы. Клещевой и комариный энцефалиты и их возбудители.
• •Экзаменационный билет № 51
• •1.Флавивирусы. Вирус лихорадки Западного Нила.
• •2.Персистенция микроорганизмов, их инвазионно-колонизационная активность и здоровое носительство возбудителей инфекционных заболеваний. Значение латентных инфекций.
• •Экзаменационный билет № 52
• •1.Возбудители вирусных острых кишечных инфекций: ротавирусы, вирусы гепатитов а и е.
• •2.Реакция иммобилизации спирохет, примеры применения. Реакция иммунного прилипания. Практическое значение.
• •Экзаменационный билет № 53
• •1. Возбудители парентеральных вирусных гепатитов в, d, c, g, их роль в патологии печени и вирусоносительстве.
• •2.Иммуноферментный и радиоиммунологический методы, сущность, применение.
• •Экзаменационный билет № 54
• •1.Ретровирусы. Вич-инфекция (спид) и ее возбудители.
• •2.Полимеразная цепная реакция (пцр).
• •Экзаменационный билет № 55
• •2. Основные исторические этапы учения о наследственности и изменчивости микробов. Вклад отечественных и зарубежных ученых.
• •Экзаменационный билет № 56
• •1.Роль вирусов в этиологии опухолей (днк- и рнк-вирусы).
• •Экзаменационный билет № 57
• •1.Патогенные грибы – возбудители профессиональных и бытовых микозов (мукоромикоз, аспергиллез, пенициллиоз и пр.).
• •2.Понятие о плазмидах, их виды, определение, значение.
• •Экзаменационный билет № 58
• •1. Условно-патогенные грибы – возбудители кандидомикоза, условия развития.
• •2.Пол бактерий и плазмиды фертильности, видовая и межвидовая конъюгация, значение для изменчивости микроорганизмов.
• •3.Из носоглоточного смыва больного выделена чистая культура золотистого стафилококка. Всегда ли можно утверждать, что она причина болезни. Как доказать, что данный штамм – возбудитель заболевания?
• •Экзаменационный билет № 59
• •1. Патогенные грибы и поверхностные дерматомикозы (трихофития, микроспория, парша, эпидермофития).
• •2.Направленная изменчивость микроорганизмов, ее практическое применение в генной инженерии.
• •3.Из желчи переболевшего брюшным тифом выделен возбудитель названного заболевания. Как оценить данную ситуацию? Болен ли человек в настоящее время?
• •Экзаменационный билет № 60
• •1. Патогенные грибы и глубокие микозы (гистоплазмоз, криптококкоз и пр.).
• •2.Фенотипическая изменчивость, сущность, формы, практическое значение. Роль экологии.
• •3.Из организма практически здорового человека выделен заведомо патогенный вид микроба. О чем это свидетельствует? Почему возбудитель болезни присутствует в организме, а заболевание не проявляется?
• •Экзаменационный билет № 61
• •1. Плазмодии малярии и малярия.
• •2.Генотипическая изменчивость. Трансформационная изменчивость, значение для диагностики и профилактики инфекционных заболеваний.
• •1. Возбудитель амебиаза и амебиаз.
• •2. Генотипическая изменчивость. Трансдукция и лизогенная конверсия, значение для науки и практики.
• •3. У двух реконвалесцентов проведены бактериологические исследования. У одного возбудитель не обнаружен, у другого – выявлен. Как оценить исход заболевания? с чем это может быть связано?
• •Экзаменационный билет № 63
• •1.Лейшмании, кожный и висцеральный лейшманиоз.
• •Экзаменационный билет № 64
• •1. Токсоплазмы и токсоплазмоз.
• •2.Влияние физических и химических факторов на микробы. Мутация и ее значение в практической медицине.
• •3. У больного гриппом выявлена пневмония, вызванная стафилококком. Как называется такая форма инфекции? Объясните причины ее возникновения. Приведите другие примеры такого сочетания.
• •Экзаменационный билет № 65
• •1. Трипаносомы и трипаносомоз.
• •Экзаменационный билет № 66
• •3. Крышка на банке с заготовленными впрок грибами вздулась. Наметить план установления причины порчи продукта.
• •Экзаменационный билет № 67
• •1. Балантидии и лямблии, их роль в патологии человека.
• •3. Микробное число в пробе колодезной воды 15 мт/мл, коли-индекс равен 2, но обнаружен вибрион Эль-Тор. Дать заключение о пригодности воды данного источника.
• •Экзаменационный билет № 68
• •2.Стерилизация, сущность, варианты, применение. Контроль качества стерилизации.
• •3. Коли-титр воды открытого водоема 550 мл, из нее выделен брюшнотифозный бактериофаг в высоком титре. Пригодна ли вода данного водоема в качестве питьевой?
• •Экзаменационный билет № 69
• •1. Кампилобактерии и кампилобактериоз.
• •2.Влияние химических факторов среды на микробы. Дезинфекция, дезинсекция, дератизация, назначение. Контроль эффективности.
• •Экзаменационный билет № 70
• •1. Госпитальные (внутрибольничные) инфекции и их возбудители.
• •Способствующие факторы
• •Группа риска
• •2.Микробиология народному хозяйству и медицине. Микробиологическая биотехнология.
• •Экзаменационный билет № 71
• •1.Инфекционные «болезни цивилизации» (легионеллез, псевдотуберкулез, вич-инфекция).
• •2.Нормальная микрофлора человека, ее значение в жизнедеятельности организма. Способы восстановления микрофлоры.
• •Экзаменационный билет № 72
• •1. Дисбактериоз, роль микроорганизмов в развитии и предрасполагающие условия.
• •3. С какого дня болезни следует проводить серологические исследования при брюшном тифе у детей и взрослых? Какие титры агглютининов считают в этих случаях диагностическими?
• •Экзаменационный билет № 73
• •1. Инфекционные заболевания в медицине катастроф.
• •2.Риккетсии, классификация, общие биологические свойства, методы выявления.
• •3. В стационаре у ребенка с диагнозом “Острая бронхопневмония” обнаружена дисфункция кишечника. Как установить этиологию патологии? Каковы причины кишечной патологии.
• •Экзаменационный билет № 74
• •1. Медленные инфекции – прионозы.
• •2.Хламидии, морфо-физиологические свойства, способы выявления.
• •3. С какого дня болезни следует проводить серологические исследования при брюшном тифе у детей и взрослых? Какие титры агглютининов считают в этих случаях диагностическими?
• •Экзаменационный билет № 75
• •2. Микоплазмы, морфология, структура, физиологические особенности, методы выявления.
• •Экзаменационный билет № 76
• •1. Патогенные спирохеты, сифилис.
• •3.У больного, поступившего в стационар с диагнозом “Пищевая токсикоинфекция”, резко нарастают явления обезвоживания. Как, с помощью, каких методов, можно установить причину?
• •Экзаменационный билет № 77
• •1. Стафилококки и стафилококковые инфекции (стафилококкозы).
• •2. Микрофлора воды и ее значение для здоровья человека. Принципы санитарно-бактериологического анализа и оценки. Способы очистки воды от микробов.
• •2. Микрофлора почвы. Её значение в развитии патологии человека.
• •Экзаменационный билет № 79
• •2.Микрофлора продуктов питания. Её роль в развитии заболеваний. Методы определения и дифференциальной оценки.
• •Экзаменационный билет № 80
• •1. Менингококки и менингококковая инфекция.
• •2. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Сущность, техника, варианты, применение.
• •Экзаменационный билет № 81
• •1. Гонококк и гонококковая инфекция.
• •3. На прибывшем в порт судне обнаружены трупы грызунов. Наметить план лабораторной индикации возбудителя, противоэпидемических мероприятий.

1.
Общие положения.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ УРОВНЯ АНТИТЕЛ
К ВИРУСУ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ В РЕАКЦИИ
ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
(РТГА)

(утверждены 28 июня 1997 г., № 13-7-2/988)

1.1. Настоящие методические указания предназначены для серологического контроля напряженности иммунитета к ньюкаслской болезни (НБ), оценки эффективности иммунизации, определения оптимальных сроков вакцинации (ревакцинации) птицы, а также для контроля эпизоотической ситуации по НБ в хозяйствах.

1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови специфических к вирусу НБ антител (антигемагглютининов) в реакции торможения гемагглютинации.

1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скорректированы исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хозяйстве.

1.4. Исследованию подлежат не менее 26 проб сывороток крови от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не менее 0,5 см3.

1.5. Результаты каждого серологического исследования должны быть зарегистрированы в специальном журнале и проанализированы ветеринарным врачом хозяйства.

2. Методика постановки реакции торможения гемагглютинации.

2.1. Оборудование и реактивы:

— антиген сухой вирусвакцины против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1» или «ГАМ-61» или экстраэмбриональная жидкость куриных эмбрионов, инфицированных этими штаммами, с гемагглютинирующим титром не ниже 1:8;

— испытуемые сыворотки птиц;

— 0,7 или 1 %-ная взвесь эритроцитов петуха на физиологическом или фосфатно-буферном растворе (pH 7,2 — 7,4) для исследований в микро- и макроварианте соответственно;

— пипетки мерные;

— микротитраторы одно- и восьмиканальные любой модели с варьируемым или стабильным объемом в пределах 0,025 — 0,05 см3.

2.2. Подготовка антигена,

2.2.1. Вакцину в ампулах (флаконах) ресуспендируют в физиологическом растворе до исходного объема вируса.

2.3. Приготовление взвеси эритроцитов петуха.

Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2 — 3 %-ным раствором лимонно-кислого натрия на физиологическом растворе (pH 7,2 — 7,4) в соотношении 1:2, трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из осадка эритроцитов на физиологическом растворе (pH 7,2 — 7,4) готовят 0,7 или 1 %-ную суспензию. Хранить суспензию можно в условиях холодильника (4 °С) до появления признаков гемолиза эритроцитов.

Кроме нативных, в работе могут быть использованы стабилизированные (формалинизированные) эритроциты петуха.

2.4. Получение сыворотки крови.

2.4.1. Кровь берут из подкрыльцовой вены или путем скарификации гребня, собирают в стерильные пробирки, предварительно увлажненные стерильным физиологическим раствором. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при комнатной температуре в течение 12 — 18 ч или при температуре 37 °С (термостат) в течение 60 мин, а затем 8 — 10 ч при 4 °С (холодильник). Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки и исследуют в РТГА.

2.4.2. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови прогревают на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.

2.5. Реакцию торможения гемагглютинации проводят в два этапа:

— определение гемагглютинирующего титра вируса в реакции гемагглютинации (РГА) для расчета рабочей дозы;

— определение титра антител в пробах сыворотки крови.

Реакцию ставят макро- или микрометодом.

2.5.1. Постановка реакции гемагглютинации.

Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда полистероловой микропанели микро-титратором разливают физиологический раствор (0,05 или 0,25 см3), в первую вносят в равном объеме вакцинный вирус, трехкратно пипетируют и переносят 0,05 или 0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или 0,025 см3 удаляют и обезвреживают в 2 %-ном растворе едкого натра.

После разведения вируса во все лунки вносят 0,7 %-ную суспензию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиологического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18 — 20 °С). Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию и определения времени учета реакции в две лунки с физиологическим раствором (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов.

РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде хорошо выраженного «зонтика», отрицательно — в виде «пуговки». За титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика». Получение нечетких результатов может быть связано с изменившимся pH физиологического раствора.

Реакция может быть поставлена макрометодом в полистероловых макропанелях, для чего все компоненты берут в объеме 0,2 см3. При этом в работе используют 1 %-ную суспензию эритроцитов петуха.

2.5.2. Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого вируса (4 ГАЕ) исходя из его титра.

Для этого исходный вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра на 4.

Например: титр вируса 1:256. Для приготовления рабочего разведения необходимо взять 63 см3 физиологического раствора и 1 см3 исходного вируса (256:4 — 64).

Объем рабочей дозы вируса определяют, исходя из количества подлежащих исследованию сывороток. Для постановки РТГА микрометодом на исследование 1 сыворотки требуется 0,6 или 0,3 см3 4 ГАЕ вируса (в зависимости от первоначального объема физиологического раствора), макрометодом — 2,4 см3.

2.5.3. Рабочую дозу вируса готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.

Для этого в 4 лунки разливают физиологический раствор в объемах, выбранных для постановки реакции. В первую добавляют равный объем рабочей дозы вируса и титруют согласно п. 2.5.1.

Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле.

При правильном определении рабочей дозы в первой, второй лунках должна быть полная агглютинация («зонтик»), в третьей — частичная, в четвертой — отсутствие агглютинации («пуговка»).

Полная агглютинация в третьей лунке означает, что доза вируса завышена, а отсутствие агглютинации в первой или во второй лунках свидетельствует о недостаточном его количестве. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят добавлением вируса или физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.

2.6. Постановка РТГА.

2.6.1. Для постановки реакции во все лунки полистероловой микро- или макропанели вносят физиологический раствор в объеме 0,05 (0,025) или 0,2 см3. Затем в первую лунку добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разделений (с 1:2 до 1:4096).

После этого во все лунки вносят рабочее разведение вируса в объеме 0,05 (0,025) или 0,2 см3, осторожно встряхивают и после 26 — 30 мин контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора) суспензии эритроцитов,

2.6.2. Контроля;

— сыворотки на изоагглютивацию (сыворотка + физиологический раствор в равных объемах + 1 %-ная суспензия эритроцитов в двойном объеме). Агглютинация должна отсутствовать;

— эритроцитов на спонтанную агглютинацию (суспензия эритроциты + физиологический раствор в равных объемах). Агглютинация должна отсутствовать.

2.6.3. Реакцию учитывают через 25 — 40 мин. При наличии в сыворотке антител наблюдают торможение гемагглютинации — эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки»,

Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение» дающее полное торможение гемагглютинации 4 ГАЕ вируса НБ.

2.7. Интерпретация полученных результатов.

2.7.1. По результатам РТГА определяют эффективность иммунизации в партии привитых цыплят путем деления суммарного количества проб с титром антител 1:8 и выше (после применения живых вакцин) или 1:16 и выше (после применения инактивированных вакцин) на общее число исследованных сывороток и выражают в процентах.

2.7.2. Птицу считают невосприимчивой к НБ при эффективности иммунизации 80 и более процентов после применения живых вирусвакцин и 90 и более процентов после использования инактивированных препаратов.

2.7.8. При эффективности иммунизации менее 80 % после применения живых вирусвакцин или менее 90 % после применения инактивированных вирусвакцин птица подлежит повторной вакцинации.

2.7.4. Обнаружение в РТГА высокого уровня антител (1:2048 и выше у птиц» привитых живыми вакцинами, и 1:4096 и выше у птиц, привитых инактивированными вакцинами) свидетельствует о возможной циркуляции в стаде полевого вируса ньюкаслской болезни. В таких случаях через 21 — 30 дней проводят повторное исследование проб сывороток крови, полученных от этих же птиц.

2.7.5. Снижение или стабилизация уровня антител и (или) уменьшение количества птиц с высоким уровнем антител при повторных исследованиях проб сыворотки крови свидетельствует об отсутствии циркуляции в хозяйстве эпизоотического вируса и является следствием поствакцинальных реакций.

2.7.6. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с высоким уровнем антител при отсутствии клинических и патологоанатомических признаков НБ не является основанием для объявления хозяйства неблагополучным по данному заболеванию, но предусматривает установление за птицей тщательного наблюдения, проведения систематических серологических и вирусологических исследований.

2.7.7. Нарастание титров и (или) увеличение количества птице высоким уровнем антител при наличии клиникопатологоанатомических признаков заболевания служит основанием для проведения детального эпизотологического обследования хозяйства и установление окончательного диагноза по данному заболеванию.

2.7.8. Обнаружение антител к вирусу ньюкаслской болезни у птиц, не привитых против НВ, без клинических и патолоанатомических признаков заболевания свидетельствует о циркуляции полевых лентогенных штаммов вируса ньюкаслской болезни и не является основанием для объявления хозяйства неблагополучным по НВ. За птицей таких хозяйств устанавливают постоянное наблюдение.

С утверждением настоящих Методических указаний на территории Российской Федерации отменяются «Методические указания по серологическому контролю напряженности иммунитета при ньюкаслской болезни птиц с помощью реакции задержки гемагглютинации» № 115-6а от 18.06.79.

Методические указания по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации разработаны сотрудниками лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.