Содержание

Метод мембранных фильтров.

Метод разработан еще в Советском Союзе и получил широкое распространение в лабораториях пищевых предприятий. По сравнению с другими методами имеет ряд преимуществ, так как сокращает срок анализа до 24 ч, менее трудоемок, дает возможность выявить даже незначительное число микроорганизмов в воде, проводить прямой и точный подсчет колоний и выделять их в чистую культуру.

Мембранные фильтры представляют собой пористые нитроцеллюлозные пленки диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм. Характеризуются следующим диаметром пор (мкм): № 1 — 0,35; № 2 — 0,5; № 3 — 0,7; № 4 — 0,9 и № 5 — 1,2. Для учета бактерий группы кишечной палочки в воде применяют фильтр № 3. Предварительные фильтры, назначение которых очистить воду от грубовзвешенных частиц, имеют поры диаметром 3—5 мкм.

Для фильтрования пользуются приборами Зейтца, которые стерилизуют в автоклаве или при помощи смоченного спиртом тампона и обжигания. Мембранные фильтры вынимают из фабричной упаковки и проверяют на отсутствие повреждений — трещин, разрывов, надломов. Перед использованием фильтры помещают в стакан с дистиллированной водой, подогретой до температуры 50—60 °С, выдерживают в течение 20—30 мин, после чего воду сливают и заменяют свежей. Так поступают 2—3 раза. Затем фильтры кипятят 1 мин, воду удаляют, наливают свежую, кипятят в течение 15—20 мин для полного удаления воздуха и органических растворителей, применявшихся при их изготовлении. Сильного кипения не допускают, чтобы не разрушить поры фильтра. Подготовленный фильтр захватывают стерильным пинцетом с гладкими краями и укладывают матовой стороной вверх на асбестовую пластинку, лежащую на металлической сетке прибора Зейтца. На фильтр осторожно устанавливают воронку, плотно закрепляют металлическими зажимами или завинчивают. В воронку наливают исследуемую воду и прибор соединяют с водоструйным электрическим насосом или насосом Камовского.

При исследовании водопроводной воды (пива, безалкогольных напитков, промывных вод) для анализа берут 300—500 мл. Для воды, исследуемой впервые, следует брать 1000, 500, 100, 10, 5 и 1 мл. Очень загрязненные воды перед фильтрованием разбавляют стерильной водой. Если фильтруют 1 мл жидкости и меньше, в воронку фильтровального прибора наливают около 10 мл стерильной воды, затем вносят исследуемую пробу.

По окончании фильтрования воронку снимают и обожженным пинцетом переносят фильтр в чашку Петри на поверхность среды Эндо матовой стороной вверх, избегая образования пузырьков воздуха между агаром и фильтром. Капли воды на нижней стороне фильтра предварительно удаляют стерильной фильтровальной бумагой. На чашке обычного диаметра помещают четыре-пять фильтров. На дне чашки под фильтром делают надпись с указанием даты посева, номера анализа и объема профильтрованной воды. Посевы выращивают в термостате при температуре 37 °С в течение 18—24 ч. После окончания термостатирования с помощью лупы подсчитывают колонии, типичные для кишечной палочки. Из двух-трех колоний приготавливают мазки и окрашивают по Граму. Грамотри- цательные бактерии высевают в «бродильные» пробирки с 5 мл глю- козо-пептонной среды (среда Эйкмана). Посевы помещают на 24 ч в термостат при температуре 43 °С. Образование в пробирках газа и помутнение дает положительный ответ на присутствие в исследуемой воде бактерий группы кишечной палочки. Подсчитывают общее количество колоний грамотрицательных бактерий, сбраживающих среду Эйкмана с образованием газа. Например, на фильтре выросло пять типичных колоний, количество профильтрованной воды 500 мл. Следовательно, одна кишечная палочка находилась в 100 мл, т.е. коли-титр равен 100, коли-индекс — 10.

По окончании анализа мембранные фильтры снимают со среды, помещают в чашку Петри с кусочком ваты, смоченным формалином.

Дезинфицированные фильтры сушат на воздухе и вклеивают в книгу анализов.

Метод мембранных фильтров

1. Воду пропускают через мембранный фильтр №3 (диаметр пор = 0,7 мкм). Мембранные фильтры перед фильтрованием стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.

Воду из водопроводной системы Москвы и Санкт-Петербурга и воду артезианских скважин фильтруют в объёме 500 мл, воду других городов – в объёме 333 мл.

2. Фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри.

3. Инкубируют при 37° C в течение суток и подсчитывают количество выросших колоний, типичных для E. coli.

4. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму, а также ставят оксидазный тест. Если в мазках видны грам «-» мелкие палочки, которые являются оксидазоотрицательными, то результат считается положительным.

5. 2-3 такие колонии засевают в разведённую среду Эйкмана и инкубируют в течение суток при 37° C. Если в пробирках имеется газообразование, дают окончательный положительный ответ на наличие E. coli.

Коли – индекс рассчитывают по количеству красных колоний на фильтре. Например, на фильтре выросли 3 окрашенные колонии, а воды было 300 мл. Следовательно, в 100 мл – 1 клетка E. coli, а в 1000 мл – 10 клеток, т.е. коли-индекс равен 10. Исходя из этого значения коли-индекса, рассчитываем коли-титр: 1000/10 = 100. Если коли-индекс равен 5, то коли-титр равен 1000/5=200.

Нормативы по коли-титру и коли-индексу воды.

Таблица .

Коли-титр Коли-индекс
Водопроводная вода г. Москва и Санкт-Петер­бург Не менее 500 Не более 2
Водопроводная вода других крупных городов Не менее 333 Не более 3
Вода открытых водоёмов

Микробное число водопроводной воды не должно превышать 50, а дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарств, не должно превышать 10-15.

Микрофлора воздуха.

Воздух является неблагоприятной средой для микроорганизмов. Отсутствие питательных веществ, влаги, оптимальной температуры, губительное действие солнечных лучей и высушивания приводят к быстрой гибели микробов в воздухе. Но некоторые виды могут сохраняться в воздухе достаточно долго. Их распространение в воздухе связано с образованием в нём аэрозоля – системы из воздуха, капель жидкости и твёрдых частиц. Микроорганизмы адсорбируются на частицах аэрозоля и оказываются надёжно защищёнными от губительного действия УФ-лучей.

В воздухе могут встречаться до 100 видов сапрофитных микроорганизмов: пигментообразующие бактерии (микрококки, жёлтая сарцина, палочка чудесной крови и др.), спорообразующие микробы (дрожжи, плесневые грибы, актиномицеты), споровые палочки (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus), которые наиболее устойчивы к действию прямого солнечного света и высушивания.

Количество микробов в воздухе открытого воздушного пространства колеблется от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч в 1 мм3. Это зависит от степени загрязнённости воздуха частицами пыли, от температуры, от характера местности, осадков, влажности, от населённости, от времени года и т.д. Чем выше концентрация в воздухе пыли, дыма, копоти, тем больше микробов, т.к. каждая частица адсорбирует на поверхности множество микроорганизмов. Микрофлора открытого воздушного пространства в основном отражает микрофлору почвы, т.к. в воздух микроорганизмы попадают с поверхности почвы с пылью.

Воздух больших городов содержит большие количества микроорганизмов, а воздух лесов, гор, полей, лугов и также воздух над водной поверхностью отличается сравнительной чистотой. Особенно мало микроорганизмов в воздухе хвойных лесов, над ледяными и снежными просторами Арктики. Летом воздух загрязнён больше, чем зимой. Атмосферные осадки способствуют очищению воздуха от микробов.

Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений. Количество микробов в воздухе закрытых помещений зависит от их объёма, частоты проветривания, качества уборки, степени освещённости, нахождения в них людей и др. Воздух закрытых помещений отражает, в основном, микрофлору организмов людей и животных, находящихся в этих помещениях. Микроорганизмы попадают в воздух с поверхности тела (с чешуйками кожи) и через верхние дыхательные пути при разговоре, кашле, чихании.

В результате в воздух попадают и патогенные микроорганизмы: гноеродные кокки, микобактерии туберкулёза, дифтерийная палочка, палочка коклюша, сибиреязвенная бацилла, стрептококки, бактерии туляремии, риккетсии и другие. Некоторое время они могут находиться в воздухе, что связано с их устойчивостью к высушиванию и действию УФ-лучей. Через воздух они могут передаваться вместе с каплями слизи и мокроты при чихании, кашле, разговоре.

В связи с этим воздух может быть фактором передачи ряда инфекций: гриппа, кори, скарлатины, дифтерии, туберкулёза, коклюша, стрептококковых, стафилококковых и менингококковых инфекций, ангины, оспы, лёгочная форма чумы и др.

Поэтому проводится санитарно-бактериологический контроль состояния воздуха, особенно в больничных и детских учреждениях, в аптеках.

Оценка санитарного состояния воздуха.

Состояние атмосферного воздуха оценивается по микробному числу .

Тесты для идентификации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов

Стафилококки Морфологически Staphylococcus- грамположительные кокки, располагающиеся в виде характерных «виноградных гроздей». Патогенные стафилококки на кровяном агаре образуют колонии диаметром 2—3 мм, окруженные прозрачной зоной гемолиза; на молочно- или желточно-солевом агаре — колонии, окруженные зоной просветления (протеолитическая активность) и радужным венчиком (наличие фермента- лецитовителлазы).

Из подозрительных колоний делают высев на скошенный мясопептонный агар для выделения чистой культуры. После 24 ч инкубации при температуре 37°С проверяется плазмо коагулирующая активность культуры посевом в пробирки с 0,5 мл цитратной плазмы (человеческой или кроличьей) в разведении 1:4. Патогенные стафилококки коагулируют плазму в течение 2—24 ч в условиях термостата. Учет производят через 1, 2, 4 и затем 24 ч по образованию небольшого желеобразного сгустка на дне пробирки. Выделенные стафилококки подвергаются фаготипированию при необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей распространения.

Стрептококки Один из представителей — Str.viridans (зеленящий стрептококк) — постоянный непатогенный обитатель зева. На кровяном агаре Streptococcus образуют мелкие (точечные) сероватые колонии с прозрачной зоной гемолиза (Р~ гемолитические) и колонии с зеленовато-бурым ореолом и повышенной прозрачностью среды (а-зеленящие). На кровяном агаре нередко рост стрептококков подавляется быстрорастущей другой микрофлорой воздуха. Поэтому учет лучше вести на чашках с элективными средами — Гарро и Туржецкого, в которые для подавления сопутствующей флоры добавляется генциан фиолетовый, обладающий бактериостатическими свойствами в отношении сапрофитов воздуха. Культивирование проводят при 37°С. После подсчета выросших колоний из подозрительных на стрептококки делают мазки (стрептококки располагаются короткими цепочками или скоплениями) и затем пересевают на кровяной агар или в сахарный бульон. В бульоне стрептококки образуют цепочки, в чем необходимо убедиться с помощью микроскопии мазков, приготовленных из характерного придонного осадка (в виде хлопьев или крошек на дне пробирки при прозрачном бульоне).

Опытным путем установлена следующая зависимость: если в 2-х чашках после экспозиции в 20 мин развилось 2 колонии, то воздух считают чистым, если 3-4- слабо загрязненным. В классах после занятий исследователями улавливалось до 50000 клеток зеленящего стрептококка в 1м3.

Escherichia coli Колонии со среды Эндо пересевают в лактозный бульон с борной кислотой или в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, предварительно нагретые до температуры 43-44°С (в водяной бане), и сразу после засева теплые пробирки помещают в термостат при температуре 43 °С на 24 ч. Борная кислота и бриллиантовый зеленый, добавляемые в среды, являются ингибиторами сопутствующей флоры. Появление газообразования свидетельствует о присутствии Е. coli в исследуемой воде. Если нет возможности сделать посев в лактозный бульон с борной кислотой, то идентификацию Е. coli проводят по двум признакам: ферментация лактозы при температуре 44,5°С в течение 24 ч и способности образовывать индол. В этом случае подозрительные на Е. coli колонии засевают параллельно в 2 пробирки: одну с полужидкой средой с лактозой, вторую — со средой для определения индола (бульон Хоттингера, пептонная вода или другая среда, содержащая триптофан), под пробку пробирки вставляют индикаторную бумажку на индол и инкубируют при температуре 44,5°С. Посевом в пробирки со средой ФКП-1 идентификация упрощается, так как в этой среде содержатся лактоза и триптофан. Положительный ответ дается при образовании газа (разложение лактозы) и индола (ферментация триптофана).

Тест Грегерсена Этим тестом можно заменить окраску по Граму. В капле 3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. Спустя несколько секунд после перемешивания за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность исследуемой колонии к грамотрицательному виду. Грам(+) бактерии слизистые нити не образуют.

Каталазный тест Наносят 1-2 капли 3% перекиси водорода непосредственно на исследуемую колонию. Появление пузырьков свидетельствует о выделении бактериями каталазы.

Оксидазный тест Тест проводят с колониями микроорганизмов, выросшими на среде Эндо. Часть подозрительных колоний стерильной петлей переносят на фильтровальную бумагу, пропитанную реактивом: диметил-п-енилендиамином и а-нафтолом. Если микроорганизмы, выросшие на фильтре, выделяют оксидазу, цвет колонии через 2—5 мин изменяется на сине-фиолетовый. Такие колонии не учитывают при анализе воды. Можно на фильтровальную бумагу с индикатором накладывать весь фильтр с выросшими на нем колониями. Колонии БГКП темно- красного цвета не изменяют своей окраски (так как кишечные палочки оксидазоотрицательны) и учитываются как представители фекального загрязнения воды.

В сомнительных случаях — при наличии колоний розовых или бесцветных (лактозоотрицательных), не обладающих оксидазной активностью, дополнительно определяют способность бактерий ферментировать глюкозу при температуре 37° С и проявлять протеолитическую активность на среде Эндо с молоком. Колонии учитывают как БГКП, если они образованы грамоотрицательными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не обладающими протеолитической активностью.

Список рекомендуемой литературы

1. Мудрецова-Висс К.А., Кудряшова А.А., Дедюхина В.П. Микробиология, санитария и гигиена: учеб. для вузов. -7-е изд. — М.: ИД «Деловая литература», 2001. — 388 с.

2. Санитарная микробиология / Н.В. Билетова, Р.П. Корнелаева, Л.Г. Кострикина и др. Под ред. С.Я. Любашенко. — М.:Пищ.пр-сть, 1980.-352 с.

3. Мармузова Л.В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности. — М.: ИРПО, Академия, 2000. — 132 с.

4. Фомин Г.С. Вода. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам: энциклопедический справочник. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во «Протектор», 2000. — 848 с.

5. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. А.А.Воробьева, Ю.С.Кривошеина. — М.: Мастерство, Высш.шк., 2001.-224 с.

6. Санитарная микробиология и вирусология / З.Н. Кочемасова, С.А. Ефремова, A.M. Рыбакова — М.: Медицина, 1987. — 352 с.

7. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды: методические указания. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. — 42 с.

8. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер.с англ. / Под ред. Дж. Хоулта и др. — М.: Мир, 1997.

9. Методы общей бактериологии: В 3-х т.- Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983.

Реакция Грегерсена: суть анализа, показания и подготовка к исследованию

Многие заболевания ЖКТ сопровождаются кровотечениями. Однако не всегда можно обнаружить такой опасный симптом невооруженным глазом. Геморрагия часто бывает скрытой. Иногда кровь невозможно заметить даже при микроскопии каловых масс. В таких случаях на помощь приходит анализ, который называют реакцией Грегерсена. Он позволяет определить в фекалиях кровяные клетки. Иначе это исследование называют анализом кала на скрытую кровь.

Суть анализа

Реакцию Грегерсена также называют бензидиновой пробой. Для проведения анализа готовят состав из раствора бензидина, уксусной кислоты и перекиси водорода. Кал наносят на стекло и добавляют несколько капель реактива. Если в фекалиях содержится даже малейшая примесь крови, то появляется синяя или зеленая окраска.

Больному приходится строго соблюдать специальную диету перед проведением реакции Грегерсена. Анализ кала может дать ошибочные результаты, если пациент употреблял накануне еду, богатую железом. Реактив с бензидином чувствителен к кровяным пигментам, которые поступают в ЖКТ из пищи.

Показания

Такой анализ врачи назначают, если у пациента отмечается следующая симптоматика:

  • постоянные боли в брюшной полости, которые носят разлитой характер и не имеют четкой локализации;
  • частые диспепсические явления (метеоризм, изжога, тошнота, рвота);
  • диарея неясной этиологии;
  • беспричинное резкое похудение;
  • плохое переваривание пищи;
  • наличие признаков кровотечения из ЖКТ, которое не обнаруживается при обычном анализе кала;
  • анемия неясного происхождения.

Реакцию Грегерсена обязательно назначают, если у больного диагностированы язвенные процессы в желудке и двенадцатиперстной кишке, колит, а также злокачественные опухоли в прямой кишке. Эти заболевания очень часто сопровождаются повреждениями тканей и кровотечениями.

Такой анализ также рекомендуется сдавать в целях профилактики пациентам старше 40 лет. Это исследование особенно необходимо при плохой наследственности по онкологическим заболеваниям ЖКТ.

Подготовка к исследованию

Как уже упоминалось, это исследование требует особой подготовки. Реакция Грегерсена на скрытую кровь может дать ложные результаты при любом нарушении диеты. Ведь состав с бензидином дает окраску в присутствии железа. А этот элемент содержится не только в кровяном гемоглобине, но и в пище.

Врачи рекомендуют соблюдать следующие правила перед прохождением теста:

  1. За 3 дня до анализа прекратить есть мясо, рыбу, морепродукты, а также употреблять спиртное. Из рациона исключаются овощи, фрукты и ягоды зеленого и красного цвета. Допускается есть только блюда из картофеля, круп и яиц, а также молочные продукты.
  2. Исключается прием препаратов и пищевых добавок, содержащих железо.
  3. Женщинам нельзя делать такой анализ во время месячных. К ложному результату может привести попадание даже небольшого количества крови в фекалии.
  4. Перед исследованием не рекомендуется пользоваться слишком жесткой зубной щеткой, чтобы случайно не поцарапать десну. Этот тест настолько чувствителен, что может отреагировать даже на заглатывание капиллярной крови изо рта.
  5. За неделю до анализа не следует ставить клизмы и пользоваться ректальными свечами.

Важно также правильно собрать материал для пробы. Нужно заранее подготовить чистый горшочек. Забирать кал из унитаза недопустимо.

Массы нужно собрать из горшка и переложить в стерильную емкость. Контейнер для сдачи анализа нужно приобрести в аптеке. Использовать для этого банки из-под продуктов крайне нежелательно.

Собранный материал нужно отнести на исследование в течение 2 часов. Хранить его не следует, иначе анализ может дать искаженные результаты.

Расшифровка

Нормальным результатом реакции Грегерсена считается полное отсутствие кровяных клеток в фекалиях. В этом случае кал не окрашивается при воздействии бензидина. Отрицательный результат теста означает, что кровь не обнаружена.

Положительный результат анализа говорит о том, что в кале обнаружен гемоглобин. Чаще всего это свидетельствует о наличии патологии. Однако нельзя исключать и ложный результат при нарушении правил подготовки к пробе. В таких случаях анализ повторяют.

Если обнаружена кровь

Что делать, если при реакции Грегерсена в кале обнаружены кровяные клетки? Необходимо показать результаты теста врачу-гастроэнтерологу. Анализ может лишь констатировать наличие крови, однако на его основании невозможно поставить точный диагноз. Ведь кровотечениями сопровождаются многие патологии ЖКТ.

Поэтому врачи назначают дополнительную диагностику, чтобы определить точную локализацию патологии. Пациенту рекомендуют пройти следующие исследования:

  • МРТ и КТ органов пищеварения;
  • рентген желудка и кишечника с контрастным веществом;
  • фиброгастродуоденоскопию;
  • колоноскопию;
  • ректороманоскопию.

Кровь в каловых массах может быть признаком геморроя, анальных трещин, полипов кишечника, колита, язвенных процессов в органах пищеварения. Эти болезни обычно хорошо поддаются терапии. Однако в некоторых случаях кровотечение может быть и ранним проявлением опухолей органов ЖКТ. Исследование на скрытую кровь помогает выявить онкологические заболевания на начальной стадии и своевременно приступить к лечению.

Важность раннего выявления туберкулеза

Раннее выявление туберкулёза имеет огромное значение для пациента, так как напрямую влияет на скорость исцеления с количеством негативных последствий, остающихся после заболевания. Проникая в лёгкие человека, МБТ (микобактерии туберкулёза) начинают очень медленно размножаться делением один раз в 24 часа. При этом они образуют очаг холодного воспаления в тканях органа (каверну), который организм в целях самосохранения изолирует специальной оболочкой из фиброзных клеток, образуя кистозное новообразование – фиброзную капсулу.

В данной фиброзной капсуле клетки лёгочной ткани постепенно гибнут, но из-за изолированности человек не ощущает симптомов этого процесса, поэтому заметить туберкулёз на ранней стадии можно только путём профилактической диагностики через определённые промежутки времени.

С развитием заболевания фиброзные капсулы растут, их становится всё больше, а на месте уже заживших образуются рубцы – участки соединительной ткани, не несущие функций кислородообмена и не эластичные, которые не дают органу полноценно расправляться, а также пустоты на месте разрушенных альвеол. Иногда на фоне туберкулёза начинается нагноение и некроз тканей. Данные последствия являются необратимыми и довольно часто требуют хирургического вмешательства, а избежать их можно только вовремя начав лечение сразу поле инфицирования.

Туберкулинодиагностика

Некоторые способы, как диагностировать туберкулёз на ранней стадии, широко известны, так как применяются для обязательной профилактической проверки. Это, прежде всего, обследование на туберкулёз при помощи туберкулиновой диагностики.

Суть туберкулинодиагностики заключается в естественной замедленной аллергической реакции на туберкулин. Туберкулин – это сухое вещество, получаемое из убитых и высушенных бацилл, содержащее характерные молекулы белков для МБТ, которые по большей части находятся в оболочке микобактерий.

Аллергическая реакция на туберкулин является результатом узнавания белков, из которых состоят МБТ и массовой выработке антител. Такое узнавание возможно только если в организме в результате заражения уже присутствуют подобные бактерии со сходным химическим составом. Визуально оно представляет собой папулу на месте подкожного введения препарата.

На данный момент применяется два вида туберкулиновых проб: Манту и диаскинтест, которые проводятся одинаково, но имеют разную точность.

Во время пробы Манту вводится туберкулин, который характерен не только для бацилл туберкулёза, но и для целой группы микобактерий, к которым они относятся. Поэтому положительная реакция анализа может быть результатом не только заражения туберкулёзом, но и присутствия остаточного иммунитета к БЦЖ после вакцинации или наличия в организме непатогенных разновидностей микобактерий либо латентной формы МБТ.

При проведении диаскинтеста туберкулин заменяется антигенами именно к активной патогенной форме МБТ, поэтому положительная реакция данной пробы свидетельствует о заболевании туберкулёзом, а не о склонности к нему.

Для полноты результата данные пробы проводятся одновременно, а их комплексный результат трактуется следующим образом:

Манту Диаскинтест Вывод
Выраженное положительное Положительный Пациент болен туберкулёзом.
Положительное со слабовыраженным результатом Отрицательный Пациент здоров и имеет иммунитет к туберкулёзу, так как действие прививки БЦЖ ещё не закончилось.
Выраженное положительное Отрицательный Пациент болен латентной или спящей формой туберкулёза. То есть он заражён, но не болеет и не заражает окружающих, потому что его иммунитет вовремя уничтожает выходящие из анабиоза бациллы, не позволяя им закрепиться в тканях, но имеет повышенный риск стать жертвой этой инфекции, а потому нуждается в определённой иммуностимулирующей терапии и улучшении условий жизнедеятельности.
Отрицательное Отрицательный Пациент не болен, но и не обладает иммунитетом к туберкулёзу, так как действие БЦЖ закончилось.

Туберкулиновая диагностика является очень доступной и не дрогой, а потому проводится в обязательном порядке в профилактических целях поголовно. Взрослым данный вид диагностики в массово не применяется, что обусловлено необходимостью длительное время в течение 72 часов бережно вынашивать результат, что не всегда возможно из-за профессиональной деятельности или безответственного отношения к своему здоровью большинства граждан.

Добровольно поставить туберкулиновую пробу вместо другого вида обследования взрослому никто не запрещает, достаточно просто обратиться в поликлинику к терапевту или фтизиатру. Однако многим людям туберкулиновые пробы не подходят по причине гиперрергической реакции или сильной общей аллергии на туберкулин. Как выявить туберкулёз на ранней стадии сразу после заражения таким людям?

Лабораторные методы выявления туберкулёза по крови

Пациентам, которым не подходит туберкулиновая диагностика туберкулёза, проводятся лабораторные анализы крови на присутствие МБТ в организме.

Лабораторная диагностика туберкулёза по анализу крови проводится четырьмя методами:

  • иммуноферментный анализ;
  • интерфероновый тест;
  • квантифероновый тест;
  • диагностика туберкулёза при помощи полимеразной цепной реакции.

Многие также считают, что можно определить заражение туберкулёзом путём проведения общего анализа крови, однако это не так. Общий анализ крови является лишь показателем того болен ли человек или здоров, а также может намекнуть на причину нездоровья: вирусные инфекции, бактериальное воспаление, нарушение работы внутренних органов и т. д., но выявить при помощи него именно туберкулёз невозможно.

Иммуноферментный анализ или ИФА представляет собой самое простое исследование образца крови пациента на наличие антител к микобактериям, которое является довольно неточным, так как уже упоминалось выше, микобактерии насчитывают много разновидностей, большинство из которых безопасны для человека. Кроме того, наличие антител к МБТ в крови испытуемого может быть вызвано не заражением, а проживанием в регионе с повышенным распространением данного недуга.

Интерфероновый тест (Interferon Gamma Release Assays или IGRA) проводит не каждая лаборатория. Данный анализ крови на туберкулёз представляет собой своеобразную реакцию Манту, только в пробирке и осуществляется следующим образом:

  1. Из вены пациента берётся достаточное количество крови, которое делится на 3 образца: 2 контрольных и 1 основной.
  2. В основной образец добавляются живые бациллы либо туберкулин, после чего проводится анализ на гамма-интерфероны – антитела к микобактериям, которые начинают выделять лимфоциты в случае знакомства с возбудителем.
  3. Чтобы понять уровень интенсивности выделения антител, результат анализа сравнивают с данными, полученными из контрольных образцов.

Так как суть метода полностью основана на принципе работы Манту, то соответственно, его итоги трактуются точно также.

Для получения более достоверного результата применяется квантифероновый тест на туберкулёз (QuantiFERON-TB Gold), который можно сравнить с диаскинтестом как по точности, так и по сути, так как во время исследования образца лабораторными методами определяется наличие антител именно к активной форме патогенных бацилл туберкулёза.

Молекулярно-генетические методы диагностики

Молекулярно-генетический метод диагностики туберкулёза именуется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и заключается в следующем: в анализе крови пациента или других органических образцах, например, мокроте специальными способами определяется наличие обрывков ДНК патогенных бацилл.

Помимо непосредственного заражения, данный высокоточный анализ иногда позволяет выявить его источник, что необычайно важно в случае с туберкулёзом, так как может сказать о резистентности возбудителя к тем или иным лекарствам.

Недостатком метода является его высокая себестоимость и потребность в специальном оборудовании, помещениях и высококлассных специалистах-генетиках, что может себе позволить далеко не каждая лаборатория.

Диагностика туберкулёза при помощи полимеразной цепной реакции является не просто анализом крови, а относится к молекулярно-генетическим методам диагностики.

Метод GeneXpert туберкулез представляет собой ПЦР, проводимый автоматизировано при помощи автоматизированной системы GeneXper. Если осуществлять ПЦР при помощи GeneXper, то помимо поиска источника заражения, можно произвести проверку выявленных МБТ на устойчивость к противомикотическим препаратам. Аналогом ПЦР является молекулярно-генетический метод Boom, который проводится немного другим способом.

Анализ мокроты

Анализ мокроты также является лабораторным методом. Как определить туберкулёз по мокроте:

  1. У пациента берётся мокрота и производится её посев на туберкулёз.
  2. После посева осуществляется окрашивание исследуемого материала по методу Циля-Нельсона.
  3. Затем делается мазок и осматривается под микроскопом.

Анализ мокроты является очень точным, однако, у заражённого на ранней стадии в мокрое возбудитель может и не присутствовать, к тому же у детей, да и у некоторых взрослых изъять мокроту бывает довольно проблематично. Ещё одним препятствием для массового проведения данного вида диагностики является длительность посева, из-за которой ждать результата придётся от одного до двух месяцев, что иногда бывает неприемлемо. Чаще всего посев мокроты производится для проверки бацилл, поразивших пациента на устойчивость к тем или иным видам лекарственных препаратов для назначения единственно верной терапии.

Окрашивание по Цилю-Нельсону

При помощи окрашивания по Цилю-Нельсону можно обнаружить наличие МБТ в любых тканях организма, а не только в мокроте. Данное исследование основывается на кислотоустойчивости МБТ к кислотам, а также на их общей устойчивости к любым воздействиям.

Как распознать туберкулёз методом окрашивания по Цилю-Нельсону:

  1. Образец ткани окрашивается специальным пигментом при одновременном термическом воздействии, так как иначе МБТ его не впитают
  2. Затем он помещается в кислотную среду для обесцвечивания. Все ткани образца под действием кислоты потеряют приобретённый пигмент, а МБТ – нет, так как они устойчивы к кислотам.
  3. Для более достоверного результата исследуемый материал окрашивается ещё раз, но уже в другой цвет и без термического воздействия.

В итоге МБТ резко выделяются на общем фоне под микроскопом, а при большом их количестве, можно невооружённым глазом определить наличие возбудителя по общему оттенку образца.

BACTEC

Бактек при туберкулёзе применяется, когда необходимо получить наиболее информативный результат в максимально короткое время. Бактек является современным ускоренным методом выявления заражения туберкулёзом, а также определения резистентности МБТ к различным лекарствам при помощи автоматизированной системы BACTEC MGIT 960. BACTEC MGIT 960 проводит посев за более короткое время (за 10–20 дней вместо 30–60), а также при положительном результате при помощи специальных реактивов сама проверяет размноженные бациллы на живучесть. Благодаря методу бактек диагностировать туберкулёз и назначить правильное лечение можно всего за 16–35 дней, в то время как раньше на это уходили месяцы.

Аппаратная диагностика

Аппаратная диагностика туберкулёза представляет собой обследование лёгочной ткани на наличие характерных патологических изменений. Самым эффективным аппаратным исследованием на сегодняшний день, конечно же, является томография, однако, томмограмма лёгких при туберкулёзе не применяется в целях массовой профилактической диагностики, так как требует слишком дорого оборудования. Данный метод в основном необходим для мониторинга протекания заболевания, обнаружения новых очагов или развития лёгочных осложнений.

Самой распространенной разновидностью аппаратной диагностики туберкулёза является всем знакомая флюорография, которая из-за доступности и высокой скорости проведения применяется для профилактического обследования взрослого населения на туберкулёз. Принцип флюорографии тот же – осмотр на наличие патологических изменений лёгочной ткани и определение их точного месторасположения.

Достоинство флюорографии: при помощи её можно выявить не только туберкулёз, но и другие лёгочные заболевания. Например, образование абсцессов, опухолей и др. Недостаток же – невозможность ранней диагностики заражения, так как увидеть туберкулёз при помощи флюорографии можно только после того, как он начнёт разрушать лёгкие.

Другие диагностические мероприятия при выявлении туберкулёза

Помимо вышеперечисленных методов диагностики заражения МБТ, во время лечения могут проводиться и другие мероприятия при выявлении туберкулёза, необходимые для контроля протекания заболевания:

  1. Общий анализ крови показывает эффективность применяемой лекарственной терапии.
  2. Анализ лимфатической жидкости может понадобиться при подозрении на диссеминированный туберкулёз – острую форму недуга или туберкулёзный сепсис.
  3. Ликвор при туберкулёзе исследуется в случае туберкулёзного сепсиса при подозрении на развитие менингита, вызванного МБТ.
  4. Анализ различных тканей или мочи при внелёгочных формах туберкулёза.

Из-за того, что туберкулёз по-прежнему остаётся крайне заразной распространенной трудноизлечимой инфекцией, которую довольно трудно вовремя выявить, несмотря на уже имеющееся огромное количество разнообразных методов диагностики, учёные по-прежнему ломают голову над всё новыми и новыми способами обнаружения, которые позволили бы диагностировать туберкулёз даже непосредственно после заражения и без ложноположительных или ложноотрицательных результатов.

Также проблемой диагностики является выявление резистентности к противомикотическим препаратам МБТ каждого отдельного пациента, так как бациллы имеют свойство очень быстро привыкать к лекарствам и передавать генетическую память своим потомкам.

Принцип работы полностью автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 для выявления микобактерий туберкулеза и постановки тестов на лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам

1.1.1 Характеристика питательной среды, используемой в пробирке MGIT

Содержимое пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) — это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7H9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка BACTEC MGIT Growth Supplement OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Она крайне важна для роста многих микобактерий, особенно бактерий, принадлежащих к группе M. tuberculosis. Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA.

1.1.2 Принципы детекции и постановки тестов на лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам

Кроме жидкой среды Мидлбрук 7H9, в пробирке MGIT содержатся: бескислородный флюорохром, трис — 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин пентагидрат хлорида рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC 960. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируете в единицах роста (GU — growth units).

Пробирки MGIT инкубируются при температуре 37°C с последующим анализом, осуществляемым вручную при ультрафиолетовом излучении, либо путем помещения в прибор MGIT 960, где пробирки проходят инкубацию и мониторинг степени флюоресценции каждые 60 минут. Рост микобактерий и других бактерий вызывает усиление флюоресценции. В случае с M. tuberculosis в момент положительного посева пробы наблюдается около 105-106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1мл среды. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня). Рост бактерий также может быть определен визуально в случае неоднородности и/или помутнения среды либо наличия в ней грануловидных или хлопьевидных вкраплений. Рост некоторых нетуберкулезных микобактерий (большинство из них обладает быстрым ростом) приводит к легкой замутненности, в то время как бактерии, вызывающие контаминацию, обычно вызывают выраженную мутность среды.

В основе теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулеза — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для проведения теста используются специальные держатели для 2, 3, 4, 5 и 8 пробирок. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат — контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке. Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным микобактериям, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флуоресцентности в данной пробирке будет выраженнный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960, который автоматически интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату.

1.1.3 Результаты и отчетность

Если в инокулируемой пробе присутствуют жизнеспособные микобактерии, они растут в питательной среде и обнаруживаются визуально, а также при помощи флюоресценции. О результатах сообщается только в том случае, если пробирка MGIT определена прибором как положительная и мазок, взятый из этой пробирки, также положителен на КУМ. В редких случаях пробирка MGIT может быть определена прибором как отрицательная, при этом мазок может быть положительный.

В таком случае сообщается о положительных результатах. Отчеты необходимо отсылать сразу после готовности результатов. Если идентификация требует дополнительного времени, о результатах можно сообщить как о культурах, положительных на КУМ, ожидающих идентификации. Предпочтительнее идентифицировать комплекс M. tuberculosis молекулярным зондом, при возможности, или другими экспресс-методами; о результатах сообщать сразу после идентификации.

Отчеты о негативных культурах составляются после получения протокола исследования и визуального осмотра негативных пробирок. Контаминированные культуры регистрируются после подтверждения мазком и субкультивированием на кровяном агаре.

Виды отчетов:

a. Мазок из пробы (флюорохромное окрашивание или метод Циль-Нильсена) — сообщается о положительном либо отрицательном результате и об использованном методе окрашивания. (В течение 24 часов после получения пробы, по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний, отчет нужно предоставить).

b. Культура: положительная (подтверждение — мазок на КУМ). Желательно, после выполнения идентификации — комплекс M. tuberculosis или MOTT bacilli (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний сообщить в течение приблизительно 14 дней). В дальнейшем идентифицировать микобактерии и составить отчет.

c. По завершении теста на лекарственную чувствительность определяется выявлена ли чувствительность или резистентность к каждому исследуемому препарату и сообщается в течение 28 дней (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний).

d. Культура: отрицательная после подготовки протокола об инкубации (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний в течении 42 дней).

Производительность системы

По данным исследований, с использованием жидких сред, как правило, вырабатывается больше положительных культур, чем при использовании плотных сред, при этом имеет место значительное сокращение времени выявления положительного роста. Данные многочисленных сравнительных исследований производительности BACTEC MGIT 960, BACTEC 460 TB и обычных плотных сред представлены на научных конференциях и опубликованы в журналах.

1.1.4 Недостатки метода

a. Невозможность наблюдения структуры и окрашивания колонии в жидкой среде.

b. Если в процессе деконтаминации и ингибирования добавкой PANTA остается хотя бы одна живая контаминирующая бактерия, она может вызвать заражение всей среды. Контаминация может скрыть рост микобактерий.

c. Положительную культуру из клинической пробы невозможно соотнести с колониеобразующими единицами (КОЕ), присутствующими в пробе — иногда это используется для определения важной нетуберкулезной инфекции.

d. Пробирка MGIT, кажущаяся положительной, может содержать смесь культур более одного вида микобактерий. Микобактерии с более быстрым ростом могут вызвать положительную флуоресценцию раньше медленнорастущих микобактерий. Поэтому в случае признаков наличия более одного вида микобактерий в мазке на КУМ, взятом из культуры, большую роль играет субкультивирование положительной пробирки MGIT на агарной пластинке Мидлбрука.

e. Иногда высокая конечная рН пробы может вызвать ложную кратковременную флуоресценцию датчика.

f. Смесь антибиотиков PANTA, необходимая для подавления контаминирующих бактерий, может также оказывать ингибирующий эффект на некоторые виды микобактерий помимо комплекса M. tuberculosis. Подобное ингибирование различно у разных видов бактерий и происходит в рамках одного вида. Однако общее выделение нетуберкулезных бактерий достигается на более высоком уровне в жидкой среде, нежели в плотной.

1.1.5 Тесты на лекарственную чувствительность к препаратам первого ряда: стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол (SIRE)

Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам имеют исключительную важность для назначения эффективного лечения, особенно в случаях обнаружения лекарственной резистентности к противотуберкулезным препаратам. Они также важны для последующей коррекции антибактериальной терапии, в случае ее неэффективности.

Тест на чувствительность к препаратам — стрептомицину (S), изониазиду (I), рифампицину (R) и этамбутолу (E), сокращенно SIRE, проводимый при помощи прибора BACTEC MGIT 960, представляет собой быстрый и качественный метод определения чувствительности M. tuberculosis к четырем указанным лекарственным средствам в критически допустимых концентрациях. Кроме того, при необходимости можно проводить тесты с высокой концентрацией стрептомицина, изониазида и этамбутола.

1.1.5.1 Принципы проведения теста

Культуры, выделенные от пациентов, больных туберкулезом, выращиваются с добавлением известной концентрации тестового лекарственного препарата. Также используется контрольная пробирка без добавления лекарственного средства. Если изолят больного растет на контрольной пробирке, но не растет в среде с добавлением лекарственного препарата, он определяется как чувствительный к данному препарату. С другой стороны, если он растет в обеих пробирках, тем самым устанавливается его резистентность к указанному препарату.

Существуют несколько методов проведения теста на чувствительность, самый распространенный — метод пропорций. В таком методе резистентность для большинства лекарственных средств устанавливается на уровне 1 %. Это означает, что если общая тестируемая бактериальная популяция 1 % или более резистентна к лекарственному средству, она считается резистентной в клинических целях. На протяжении длительного времени в методе пропорций используется плотная агаровая среда Мидлбрук. После 3-4 недель инкубации для определения резистентности на среде, содержащей лекарственный препарат, подсчитывается процент колоний по сравнению со средой, в которой отсутствуют лекарственные препараты.

В 1980 г. был внедрен метод пропорции на основе бульона, известный под названием — радиометрический тест на чувствительность BACTEC 460 TB. В этом методе используется радиометрическая среда BACTEC 12B с субстратом класса C14.

Бактериальный инокулят в контрольном образце в 100 раз меньше инокулята в содержащей лекарственный препарат среде. CO2, образующийся во время роста и метаболизма микобактерий в такой среде, измеряется и обозначается как индекс роста (Growth Index — GI). Как только GI в контрольном образце достигает значения 30 (обычно после 4-6 дней инкубации — максимум 1 2 дней), сравнение показателей GI в содержащей лекарственный препарат среде и не содержащей его является основой пропорции резистентности.

Тест на чувствительность с использованием BACTEC MGIT 960 был внедрен на основе аналогичных принципов, при этом увеличение флуоресценции в датчике измеряется автоматически и обозначается как значение роста (Growth Value — GV).

Если лекарственный препарат добавляется в среду, обладающую бактериостатическими или бактерицидными свойствами по отношению к тестируемым микобактериям, он ингибирует рост, таким образом, кислород поглощается либо в малых количествах, либо не поглощается совсем, поэтому отсутствует флуоресценция датчика. Результаты теста на лекарственную чувствительность, полученные при использовании системы BACTEC MGIT 960, идентичны данным, получаемым при помощи системы BACTEC 460TB, длительность исследования также примерно одинаковая. Концентрации лекарственных препаратов в тесте на чувствительность SIRE с использованием BACTEC MGIT 960 несколько ниже, чем в методе пропорций на плотной среде (во избежание ложных результатов чувствительности).

Тест на чувствительность BACTEC MGIT 960 был подвергнут детальной оценке путем сравнения со средой Мидлбрук 7H10, а также с системой BACTEC 460 TB System.

1.1.5.2 Тесты, применяемые при более высоких концентрациях лекарственных препаратов

Рекомендуется всегда тестировать лекарственные препараты ряда SIRE в критических концентрациях. Однако в некоторых ситуациях показано тестирование при более высокой концентрации. Оно играет роль для изолятов, имеющих низкий уровень резистентности, т.е. изолят проявляет резистентность при предельной концентрации, но чувствителен к высокой концентрации препарата. Поэтому во многих лабораториях сначала проводится тест при критической концентрации препарата, и в случае резистентности изолята он тестируется при высокой концентрации.

При высоких концентрациях тестируют только стрептомицин, изониазид и этамбутол. Из трех данных препаратов изониазид наиболее важен, поскольку врачи-клиницисты могут посчитать необходимым продолжить использование изониазида в терапевтическом режиме, если выделенная культура пациента резистентна при критической концентрации и чувствительна при высокой концентрации (т. н. «резистентность низкого уровня»). В продаже имеются указанные высокие концентрации стрептомицина, изониазида и этамбутола для BACTEC MGIT 960.

Конечная концентрация препарата в среде должна быть следующей:

стрептомицин 4,0 мг/мл среды

изониазид 0,4 мг/мл среды

этамбутол 7,5 мг/мл среды

1.1.5.3 Учет результатов

По завершении теста (4-21 день) на приборе появится сообщение о готовности результатов. Необходимо просканируйте штрих-код держателя и распечатать отчет. В распечатке прибора указаны результаты теста на чувствительность к каждому лекарственному препарату. Результаты имеют качественный характер: чувствительный (S),резистентный (R), либо результат теста не определен (X).

Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). В этот момент оцениваются показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом.

S-чувствительный — единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет менее 100.

R-резистентный — единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более.

X-ошибка — неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые могут повлиять на процедуру теста, например, при достижении единицей роста контрольного образца величины ?400 менее чем за 4 дня. В подобных случаях тест необходимо повторить с чистой, активнорастущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis. Некоторые лекарственноустойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо также повторить исследование.

Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды (стр. 5 )

Примечание (информационное)

Достоверность количественного результата повышается с увеличением числа идентифицированных колоний.

В частности, ГОСТ 26670—91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов» при необходимости подтверждения характерных колоний требует отбирать не менее 5 изолированных колоний с пересевом для дальнейшей идентификации на неселективную питательную среду.

Французским комитетом по стандартизации АФНОР установлены следующие правила отбора достаточного количества колоний для подтверждения.

Если принять, что n — количество типичных колоний, a n1 — необходимое количество колоний для подтверждения, то:

— при n < 5, n1 = n;

— при 5 £ n < 25, то n1 = 5;

— при n ³ 25, то n1 = (округленное до общего наивысшего количества).

13.1. Определение Грам-принадлежности

Классический способ определения Грам-принадлежности бактериальных клеток окраской по Граму с последующей микроскопией можно заменить простым и быстрым способом, не требующим оптики — тестом Грегерсена.

Исследования проводят со свежими культурами. Бактериальную массу, взятую с плотной среды, в течение нескольких секунд эмульгируют на предметном стекле в капле 3 %-ного водного раствора КОН. Образование слизи, тянущейся за петлей, указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным микроорганизмам. Грамположительные микроорганизмы в этой реакции слизь не образуют.

13.2. Постановка оксидазного теста

Используют реактивы, рекомендованные в МУК 4.2.1018—01. Предпочтительно пользоваться готовыми индикаторными системами, изготовленными промышленным способом (например, СИБ-оксидазы, диски оксидазы производства LACHEMA, MERCK, DIFCO).

Надежный результат оксидазного теста может быть получен только при использовании суточной культуры, выращенной на неселективном питательном агаре. Следует иметь в виду, что при постановке оксидазного теста путем наложения мембранного фильтра с выросшими колониями на оксидазный реактив, постановки реакции с колонией, выращенной на среде Эндо, типичные темно-красные колонии могут давать нечеткую реакцию.

Каждый раз при постановке теста (серии тестов) проводят контрольные испытания с тест культурами микроорганизмов, дающих положительную (Pseudomonas aeraginosa) и отрицательную (Е. coli) реакции.

Для постановки реакции используют пастеровскую пипетку или проверенную бактериологическую петлю, не давшую ложных реакций в указанном тесте при испытании с контролируемыми культурами.

Методика постановки

Исследуемую колонию пересевают на скошенный питательный агар. Инкубируют при (37±1) °C в течение 18—24 часов. Оксидазный диск слегка смачивают дистиллированной водой/пропитывают реактивом фильтровальную бумагу. Делают мазок культуры на диске с реактивом. Появление окраски не позднее чем через 10 секунд рассматривается как положительная реакция.

При использовании коммерческих тест-систем процедура определения выполняется согласно инструкции.

13.3. Определение ферментации углеводов

Предпочтительно исследовать 18—24-часовую субкультуру, полученную на питательном агаре. Для контроля используется жидкие или полужидкие среды, проверенные ранее, как указано в разделе 11. Посев исследуемого штамма осуществляют в среды с углеводами по общепринятым методикам. Постановка положительного и отрицательного контроля осуществляется как указано в пункте 11.6.3. Инкубацию посевов проводят согласно методической документации.

Оценку результатов проводят по окончании срока инкубации путем сравнения изменений в исследуемом посеве с изменениями в положительном контроле. Обязательным условием является отсутствие изменений отрицательного контроля.

Раздел составлен на основе:

ГОСТ 26670—91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов»;

стандарта АФНОР NF Т 90-416, 1985;

методических рекомендаций «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aerugiosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)»: МЗ СССР. — М., 1984;

ГОСТ 18963—73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа». — М., 1973;

XI Государственной Фармакопеи СССР. — М., 1998; ИСО 7218— 96;

инструкции к ОКСИ-тест(у), Лахема, Чешская Республика;

Определитель бактерий Берджи/Под ред. Дж Кинга, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. — М.: Мир, 1997.

Библиография

1. Бактериологический контроль питательных сред. Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемиологических станций и больниц. — Хабаровск: МЗ РСФСР, 1979.

2. Методические указания по бактериологическому контролю качества проведения противоэпидемических мероприятий в акушерских стационарах. Прил. 4 к приказу Комитета здравоохранения г. Москвы и ЦГСЭН в г. Москве № 000/6 от 19.11.98.

3. Руководство по аккредитации для лабораторий, проводящих микробиологическое тестирование. Европейская кооперация по аккредитации лабораторий (EAL), 1996.

4. Руководство по контролю качества питьевой воды. — Т. 1. — ВОЗ. — Женева, 1994.

5. Методы для унификации санитарно-микробиологиических исследований воды/Сборник СЭВ: Бад Эльстер, 1979.

6. Унифицированные санитарно-микробиологические методы исследований воды в странах-членах СЭВ/Сборник СЭВ. — М., 1988.

7. Council directive 98/93/EC of 3 November 1998 on the quality of water intended for human consumption. Official Journal of the European Communities. 5.12.98 / Директива Совета Европейского Союза 98/ 83/ЕС по качеству воды, предназначенной для потребления человеком/.

8. Guidelines for drinking-water quality. — V.2. — WHO. — Geneva, 1996.

9. ISO 3696—87 «Вода для аналитических лабораторных исследований. Спецификация и методы испытания».

10. ISO 8402 : 1994 (E/F/R) Управление качеством и обеспечение качества. — 2-е изд./ Словарь.

11. ISO 6887—1983 «Общее руководство по приготовлению разведении для микробиологических исследований».

12. ISO 7218 : 1996 «Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Общие правила микробиологических исследований».

13. ISO 7704—85 «Оценка мембранных фильтров, используемых для микробиологических анализов» («Water quality. Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses»).

14. ISO 8199 : 1988 «Общее руководство по определению количества микроорганизмов с помощью питательной среды».

15. ISO 9998 : 1991(Е) «Качество воды. Методы оценки и контроля микробиологического подсчета колоний в средах с применением тестов качества воды».

18. NF Т 90-414. AFNOR, 1985.

19. Programme № 000/03. Analyses des eaux. COFRAC SECTION ESSAIS, 1997.

Приложение 1

(информационное)

СТРУКТУРА ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПО ОБЪЕКТАМ КОНТРОЛЯ

Приложение 2

(информационное)

Структура организации внутреннего контроля качества в лаборатории

№ п. п.

Область контроля

Периодичность

Условия проведения испытаний

Общие помещения лаборатории «чистой зоны»

Ежедневно

Уборка и дезобработка помещений «заразной зоны»

Текущая уборка 2 раза в день, генеральная уборка 1 раз в неделю по графику

Уборка и дезобработка оборудования

По графику

Воздух боксов, ламинарных укрытий и помещения для фильтрации проб воды на обсемененность

В дни проведения работ, не реже 2 раз в неделю

Воздушный поток ламинарных укрытий на количество микрочастиц

1 раз в год

Смывы с поверхностей и оборудования

Не реже 1 раз в месяц

Процедура анализа

Положительный и отрицательный контроль подтверждающих биохимических тестов при определении: общих и термотолерантных колиформных бактерий, БГКП, фекальных стрептококков, патогенных стафилококков

Каждый раз при постановке подтверждающих биохимических тестов

Положительный и отрицательный контроль при постановке оксидазного теста

Каждый раз при постановке теста

Контроль стерильности фильтровальных установок

В день использования

Контроль качества дистиллированной воды

1 раз в месяц

Внепланово: при нестандартных результатах контроля воды, после проведения ремонта установки, замены фильтров

Контроль мембранных фильтров

При поступлении новой партии

Оборудование

Средства измерения и испытаний

Поверка и аттестация по утвержденному графику

Паровые стерилизаторы

Химический контроль

При каждой загрузке

Термический контроль

2 раза в месяц

Биологический контроль

2 раза в год

Воздушные стерилизаторы

Химический контроль

При каждой загрузке

Термический контроль

2 раза в месяц

Биологический контроль

2 раза в год

Контроль температуры в термостатах

Ежедневно

Контроль температуры в холодильниках

Еженедельно

Контроль стеклянных флаконов для отбора проб на обсемененность

Не реже 1 раза в квартал при контроле режимов стерилизации

Питательные среды

Проверка документации и визуальный контроль

При поступлении

Контроль сред на этапе приготовления (pH, внешний вид, стерильность)

Каждую варку

Качественный контроль ростовых и дифференцирующих свойств

Каждую варку

Количественный контроль ростовых, дифференцирующих и ингибирующих свойств питательных сред

При поступлении новых партий (серий) сред

При окончании срока реализации среды

При выявлении нарушений условий хранения

Ведение рабочей коллекции эталонных бактериальных культур

Создание запаса эталонных культур

1 раз в 4—5 лет

Восполнение запаса рабочих культур

1 раз в квартал

Подготовка культур для целевого использования

Ежедневно

Приложение 3

(рекомендательное)

Лист контроля температурного режима

Норматив для данного объекта

Дата

Значение температуры (°С)

Заключение

Подпись

Приложение 4

(обязательное)

ЖУРНАЛ

контроля работы стерилизаторов воздушного, парового (автоклава)

Код формы по ОКУД

Код учреждения по ОКПО

МИНЗДРАВ СССР

Наименование учреждения

Лаборатория

Медицинская документация

Форма № 000 /у

Утв. Минздравом СССР 04.10.80 № 000

марка стерилизатора _______________

зав. № стерилизатора_______________

Указать нормативно-техническую документацию (НТД) контроля работы стерилизаторов:

Дата

Подраз-деление

Стерилизуемые изделия

Упа-ковка

Время стери-лизации (мин)

Режим

Тест-контроль

Заклю-чение*

Подпись оператора

Наиме-нование

Коли-чество

Начало

Конец

Давле-ние

Темпе-ратура

Био-лог.

Тер-мич.

Хим.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *